ICS 13.020.40 CCS Z 10 44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2340.4—2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第 4 部分：生殖毒性 Mugilogobius chulae—Toxicology evaluation—Part 4: Reproduction toxicity 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 2340.4—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 原理 ............................................................................... 2 5 方法 ............................................................................... 2 6 器材 ............................................................................... 3 7 评价步骤 ........................................................................... 3 8 质量控制 ........................................................................... 5 9 结果与报告 ......................................................................... 5 10 诸氏鲻虾虎鱼安乐死 ................................................................ 6 11 实验室废弃物的处理 ................................................................ 6 附录 A（资料性） 诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法 ............................................. 7 附录 B（资料性） 诸氏鲻虾虎鱼生殖毒性评价原始记录表 ................................... 8 附录 C（规范性） VTG mRNA 和 AR mRNA 相对表达量测定方法 ............................... 16 I DB44/T 2340.4—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 DB44/T 2340《诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价》分为四个部分： ——第 1 部分：急性毒性； ——第 2 部分：摄食抑制； ——第 3 部分：生长抑制； ——第 4 部分：生殖毒性。 本文件是DB44/T 2340的第4部分。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。 本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC 93）归口。 本文件起草单位：广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人：李建军、黄韧、朱才毅、余露军、赖素群、林忠婷、陈小曲、曾进、蔡磊。 II DB44/T 2340.4—2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第 4 部分：生殖毒性 1 范围 本文件规定了诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价中生殖毒性的原理、方法、器材、评价步骤、质量控制、结 果与报告、安乐死和实验室废弃物处理等要求。 本文件适用于直接或间接排入海洋、入海河口的污染物及受纳水体的生殖毒性评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 35517-2017 化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法 SN/T 3592 实验室化学药品和样品废弃物处理的标准指南 DB44/T 2340.1-2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第1部分：急性毒性 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 生殖毒性 reproductive toxicity 指外源物质对雄性和雌性生殖功能或能力以及对后代产生的不良效应。 卵黄蛋白原 vitellogenin, VTG 一种磷脂糖蛋白，卵黄蛋白的前体，通常存在于卵生动物性成熟雌性个体中。 [来源：GB/T 35517-2017，2.1.3，有修改] 雄激素受体 androgen receptor, AR 一种配体依赖性的反转录调节蛋白，介导脊椎动物雄激素的多向效应，对性别分化、性成熟和精子 发生起重要作用。 最大耐受浓度 maximum tolerated concentration, MTC 受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度。 [来源：GB/T 35517-2017，2.1.4] 无可见影响浓度 no observed effect concentration, NOEC 实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后，通过观察实验生物的不良影响，并比较试验 组与对照组统计分析结果，判定出对实验生物无显著影响（p＞0.05）的最大浓度。 [来源：GB/T 18420.2－2009，3.2] 1 DB44/T 2340.4—2021 最低可观察效应浓度 lowest observed effect concentration, LOEC 与对照相比，对受试生物产生显著(p<0.05)效应的最低受试物浓度。 [来源：GB/T 21828-2008，2.4] 性腺指数 gonad somatic index，GSI 性腺重量相对去内脏体重的比例，是性成熟度的一个指标。 参见：GSI=（GW/SW）x 100 % 式中： GW——性腺重，单位为克（g）； SW——去内脏体重（净重），单位为克（g）。 相对生殖力 relative fecundity 指一尾雌鱼在一定产卵周期内单位体重或单位体长产出的卵子数量。 孵化率 hatching rate 从卵内破膜而出的仔鱼数量与总卵数的百分比。 不投饵存活系数 survival activity index，SAI 衡量仔鱼活力的重要指标。 参见：SAI =∑K i=1(N − hi) × i/N 式中： N——起始的仔鱼数量； K——仔鱼全部死亡所需的天数； Hi——第i天时仔鱼的累计死亡数。 4 原理 VTG是包括性成熟鱼类在内的卵生雌性动物肝脏产生的一种特有蛋白前体，由血液循环进入卵巢， 但在外源类雌激素物质的刺激下，雄鱼肝脏也能产生该蛋白前体；雄激素通过AR激活下游信号通路来行 使其功能，外源类雄激素物质的暴露可诱导AR mRNA的表达。鱼类在污染物中暴露后，通过测定肝脏组 织VTG mRNA和AR mRNA表达水平，可表征水污染物对鱼类的早期生殖毒性效应。此外，环境内分泌干扰 物可通过干扰鱼类性激素水平进而导致鱼类性腺指数、生殖力、孵化率、不投饵存活系数等生殖器官发 育和生殖能力指标异常，这些指标可用于评估受试物的生殖毒性。 5 方法 根据试液更换频次可分为静态毒性试验、半静态毒性试验和流水毒性试验。试验期间受试物实测 浓度与配制浓度偏差超过 20%或受试物稳定性不明确时，宜采用半静态毒性试验或流水毒性试验。 根据暴露时间可分为Ⅰ期生殖毒性试验和Ⅱ期生殖毒性试验。 5.2.1 Ⅰ期生殖毒性试验：试验周期为 21 d，以 VTG mRNA 和 AR mRNA 的表达量为主要检测指标。 2 DB44/T 2340.4—2021 5.2.2 Ⅱ期生殖毒性试验：试验周期为 90 d，其中包含持续暴露染毒期 30 d，转移至清水饲养期 60 d，以性腺指数、生殖力、孵化率、仔鱼不投饵存活系数作为主要检测指标。 6 器材 主要仪器设备 6.1.1 饲养诸氏鲻虾虎鱼以及饵料生物的养殖箱、水处理设备等。 6.1.2 测定环境因子的溶氧仪、盐度计、pH 计、温度计等。 6.1.3 用化学惰性材料制成的试验容器。Ⅰ期生殖毒性试验试验容器体积为 2.0 L～3.0 L；Ⅱ期生试 验容器体积为 5.0 L～10.0 L。 6.1.4 电子天平、高速搅拌器、高速台式冷冻离心机、荧光定量 PCR 仪、生物显微镜、解剖镜、血球 计数板、超净工作台、量筒、胶头滴管、移液管、手抄网等。 诸氏鲻虾虎鱼 6.2.1 性别、规格选择 根据试验要求选择雌雄鱼。诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法见附录A。 Ⅰ期生殖毒性试验应选择在水温25.0 ℃±2.0 ℃、其它条件适宜的环境下培育的（16±2）周龄雄 鱼，其个体体长宜在平均体长的±20%内。 Ⅱ期生殖毒性试验应选择在水温25.0 ℃±2.0 ℃、其它条件适宜的环境下培育的（22±2）周龄实 验鱼，其个体体长宜在平均体长的±20%内。 6.2.2 质量 按DB44/T 2340.1-2021中6.2.1的规定执行。 受试物 按DB44/T 2340.1-2021中6.3的规定执行。 7 评价步骤 样品准备 7.1.1 稀释水 按DB44/T 2340.1-2021中7.1.1的规定执行。 7.1.2 贮备液配制 按DB44/T 2340.1-2021中7.1.2的规定执行。 预试验 可采用较大的等比系数设置5个等比浓度组和1个阴性对照组。若使用助溶剂应增设助溶剂对照组， 助溶剂的浓度应与试验组中助溶剂的最高浓度一致，试验溶液中助溶剂的最高浓度不得超过0.1‰。可 3 DB44/T 2340.4—2021 不设平行组。应记录试验溶液配制过程，试