(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211018274.4 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 陈兴　刘嘉琳　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 吴爱琴 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 Click-iG： 一种多类型完整糖肽的鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了Click ‑iG： 一种多类型完整糖 肽的鉴定方法， 具体是利用非天然糖代谢标记技 术， 在细胞或活体组织样品中多种类型糖基化修 饰蛋白的聚糖链上引入一个叠氮基团， 然后通过 生物正交的点击化学反应， 使糖蛋白的聚糖链上 连接有生物素基团标签， 随后将蛋白酶解为肽 段， 再通过链霉亲和素 ‑生物素相互作用对糖基 化 修 饰 肽 段 进 行 富 集 ，最 后 通 过 基 于 sceHCDpdEThcD碎 裂技术的静电轨道离子阱高分 辨质谱进行质谱鉴定， 并使用pGlyco3软件进行 搜库分析。 所述的方法流程具有鉴定糖基化修饰 种类多、 修饰位点信息与糖链组成信息完全、 鉴 定覆盖度高等优点， 可以对复杂生物样品的N ‑糖 基化、 黏蛋白型O ‑糖基化和O ‑GlcNAc糖基化完整 糖肽进行统一鉴定， 从而实现对同一样品中多类 型糖基化修饰组学的综合研究。 权利要求书2页 说明书11页 附图6页 CN 115420821 A 2022.12.02 CN 115420821 A 1.Click‑iG： 一种多类型完整糖肽的鉴定方法， 包括如下步骤： 1)对待鉴定细胞或组织样品进行非天然糖代谢标记， 即， 将叠氮基团整合到多种类型 糖基化修饰的聚糖结构中， 使样品中糖蛋白的聚糖链上 标记有叠氮基团； 2)蛋白提取并利用点击化学反应使糖蛋白的聚糖链标记上生物素基团； 3)对所提取的蛋白进行变性、 还原、 烷基化和胰蛋白酶 酶解， 使其消化 为肽段； 4)通过链霉亲和素 ‑琼脂糖小珠对所得肽段进行富集， 并在紫外光照射的条件下将其 释放、 收集； 5)对收集的糖肽进行基于sceHCDpdEThcD碎裂方法的LC ‑MS/MS检测， 最后通过pGlyco3 软件对质谱数据进行完整糖肽解析。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤1)中， 所述待鉴定细胞或组织样品为 活细胞或活体组织样品； 步骤1)的操作为： 向细胞培养基或小鼠腹腔内加入或注射含有叠氮基团的单糖类似 物， 对细胞或活体组织样品的糖基化修饰蛋白进行聚糖标记， 使糖蛋白的聚糖链上标记有 可用于生物正交点击化学反应的叠氮基团。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于： 所述含有叠氮基团的单糖类似物具体可为 1,6‑Pr2GalNAz或1,6 ‑Pr2ManNAz。 4.根据权利 要求1或2所述的方法， 其特征在于： 步骤2)的操作为： 向步骤1)所得体系中 加入裂解液， 进行超声破碎、 离心吸取上清液， 获取裂解液； 在裂解液中加入炔基 ‑光切割‑ 生物素探针、 CuSO4/BTTAA、 抗坏血酸钠， 反应， 使生物素连接到目标蛋白上， 向所得反应体 系中加入甲醇沉淀蛋白； 所述反应在室温下进行， 所述反应的时间为2 ‑3小时。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于： 所述炔基 ‑光切割‑生物素探针的结构式为 6.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的方法， 其特征在于： 步骤3)的操作为： 将步骤2)得 到的蛋白沉淀用尿素复溶， 加入NH4HCO3， 加入二硫苏糖醇DTT， 还原反应； 向反应后的溶液中 加入碘乙酰胺IA A， 烷基化反应； 向反应后的溶 液中加入NH4HCO3， 加入胰蛋白酶， 酶解反应； 其中， 所述还原反应的温度为32 ‑37°， 时间为0.5 ‑1小时； 所述烷基化反应的温度为25 ‑29°， 时间为0.5 ‑1小时； 所述酶解反应的温度为32 ‑37°， 时间为16 ‑20小时。 7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的方法， 其特征在于： 步骤4)的操作为： 向酶解后所 得溶液中加入链霉亲和素 ‑琼脂糖小珠， 孵育； 离心， 吸除上清液； 将收集到的链霉亲和素 ‑ 琼脂糖小 珠用甲酸溶液重悬后置于紫外光下照射， 释放糖肽； 离心， 收集上清液， 干燥， 得到 糖肽干粉； 其中， 所述孵 育在室温下进行， 所述孵 育在旋转下进行， 所述孵 育的时间为2 ‑3小时； 所述甲酸溶 液为0.1％(v/v)甲酸溶 液；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115420821 A 2所述紫外光下照射的时间为5 ‑15分钟。 8.根据权利要求1 ‑7中任一项所述的方法， 其特征在于： 步骤5)中， 用于肽段分离的色 谱柱为EasySpray 反向色谱柱； 填料为PepMapC18颗粒； 色谱系统装置为Di onexUltimate3 000RPLC纳喷雾系统； 质谱采集系统为OrbitrapFusionLumos质谱仪， 其串级质谱碎裂模式为阶梯能量高能 碰撞解离 ‑靶标离子激发‑电子转移解离(sceH CDpdEThcD)； 阶梯能量高能碰撞解离 ‑靶标离子激发 ‑电子转移/高能碰撞解离(sceHCDpdEThcD)的 参数为： 归一 化碰撞能量(NC E)为20‑30‑40； EThcD的辅助激发能量(SA)为3 5； 色谱流动相A相为0.1％甲酸的水 溶液， B相为80％乙腈， 0.1％甲酸的水 溶液； 色谱流动相的梯度参数为： 0 ‑10min： B相从1％到7％； 11 ‑311min： B相从7％到35％； 311‑353min： B相从3 5％到44％； 353‑356min： B相从4 4％到99％； 质谱设置相关参数： 肽段母离子采集范围是350 ‑2000Th， 其中AGC设置为400000， 分辨 率设置为20 0m/z的条件下120 00。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115420821 A 3