(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210960221.8 (22)申请日 2022.08.11 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 陈孝仁　沈加星　靳晶豪　黄沈鑫　 (74)专利代理 机构 南京禹为知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32272 专利代理师 王晓东 (51)Int.Cl. C07K 1/14(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 一种从感染疫病的辣椒叶片中提取胞间液 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从感染疫病的辣椒叶片 中提取胞间液的方法， 其步骤包括： 培养辣椒叶 片并采集、 病原菌侵染、 冲洗叶片、 吸水纸擦干、 叶片浸入渗透缓冲液， 试管抵压使其浸没、 真空 处理、 缓慢打开瓶塞， 待叶片 全部吸水后取出， 吸 水纸擦干， 封口膜包裹叶片， 放入注射器中， 离 心， 吸取底部 液体移至新的离心管， 二次离心， 吸 取上清， 超低温保存样品； 真空渗透离心法结合 了压力法和洗脱法的简便、 高效和重现性好等优 点， 避免了其他方法对技术和设备要求高的缺 点， 可以快速简便地提取染病辣椒叶片的胞间 液， 既保证了胞间液不受胞内物质的污染， 同时 还可以获得辣椒疫霉和辣椒在胞间泌出的蛋白。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115403651 A 2022.11.29 CN 115403651 A 1.一种从 感染疫病的辣椒叶片中提取 胞间液的方法， 其特 征在于： 包括， 培养辣椒叶片并采集、 病原菌侵染、 冲洗叶片、 吸水纸擦干、 叶片浸入渗透缓冲液， 试管 抵压使其浸没、 真空处理、 缓慢打开瓶塞， 待叶片全部吸水后取出， 吸水纸擦干， 封口膜包裹 叶片， 放入注射器中， 离心， 吸取底部液体移至新的离心管， 二次离心， 吸取上清， 超低 温保 存样品。 2.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述培养辣椒叶片是在22～24 ℃、 光照16 h/黑暗8h的温室中培 养辣椒苗。 3.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述采集辣椒 叶片6周后采集辣 椒叶片， 采样前1h给辣椒 浇水， 保证叶片相同膨压 。 4.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述病原菌侵染将辣椒叶片浸泡 在浓度约600个游动孢子/ μL的辣椒疫霉游动孢子悬浮液中， 浸泡3h后取出叶片， 放在25℃ 恒温培养箱中孵 育3h。 5.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述浸入渗透缓冲液将3～6片新 鲜的辣椒叶片放入1L真空抽滤瓶中， 加入5 00mL左右的超纯 水， 用试管抵压叶片使其浸没。 6.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述真空处理是以小于2Pa压力 值处理10～15s， 缓慢打开 瓶塞， 待整张叶片被浸润后取 出叶片， 用吸水纸擦干叶片表面。 7.如权利 要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述离心为剪取10cm ×10cm的封 口膜， 将叶片按同一方向摆放在封口膜上， 封口膜一端放一个1mL的移液器枪头作为支撑， 慢慢从枪头方向卷起叶片， 整个放入10mL塑料注 射器内， 再将注 射器放入50 mL离心管中， 于 4℃、 1000g离心10mi n。 8.如权利 要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述二次离心条件为4℃、 15000g 离心5min。 9.如权利要求1所述提取胞间液的方法， 其特征在于： 所述超低温保存样品， 在保存样 品前需要对提取物进行检测， 利用试剂盒， 测定胞间液的葡萄糖 ‑6‑磷酸脱氢酶(G6PDH)和 苹果酸脱氢酶(MDH)活性， 评估胞间液受胞内物质污染的程度。 10.如权利要求9所述对提取物检测的方法， 其特征在于： 所述污染率低于3％即认为原 生质对胞间液的污染可忽略不计， 将胞间液保存在 ‑80℃超低温冰箱中。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115403651 A 2一种从感 染疫病的辣椒叶片中提取胞间液的方 法 技术领域 [0001]本发明属于细胞 间液提取技术领域， 具体涉及到一种从感染疫病的辣椒叶片中提 取胞间液的方法。 背景技术 [0002]辣椒是重要的蔬菜作物， 具有很高的药用价值及食用价值。 我国辣椒年产量约为 2013万吨， 且辣椒种植面积及产量均呈逐年增 长趋势。 由辣椒疫霉侵染引起的辣椒疫病是 辣椒上的主要病害， 极易造成辣椒猝倒、 根腐及果腐， 严重影响辣椒产量和品质。 在植物的 免疫系统中， 质外体空间对于植物抵抗病原菌侵染起着重要作用。 在受到病原物侵染时， 植 物会分泌葡聚糖酶、 几丁质酶和水解酶等到质外体空间来阻止病原物的侵染。 辣椒疫霉入 侵辣椒会产生一些物质来抵抗辣椒蛋白或蛋白酶的抑制作用。 探究辣椒胞间液中蛋白种类 及其功能对于进一 步了解辣椒疫霉侵染致病机制和作物抗病机理至关重要。 [0003]目前， 用于植物胞间液提取的方法包括压力法、 淋洗法、 离子选择电极法、 微透析 法和真空渗透离心法等， 但尚无用于提取染病辣椒叶片胞间液的方法。 这些方法中， 压力法 可能会使胞间液提取不完全； 淋洗法容易造成细胞膜的破裂和胞间液被严重稀释； 离子选 择电极法和微透析法比较耗时， 并对操作技 术要求较高， 重复性差 。 [0004]由于真空渗透离心法具有简便、 高效和重现性好等特点， 已在一些植物叶片胞间 液物质的提取中进行了尝试。 然而， 真空渗透离心法也存在细胞膜破裂导致质外体溶液被 原生质污染的问题。 辣椒被疫病危害， 加重 了胞内物质污染的风险。 发明内容 [0005]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。 在本部 分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、 说明书摘要和发明名称的目的模糊， 而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 [0006]鉴于上述和/或现有技 术中存在的问题， 提出了 本发明。 [0007]因此， 本发明的目的是， 克服现有技术中的不足， 提供一种从感染疫病的辣椒叶片 中提取胞间液的方法。 [0008]为解决上述技术问题， 本发明提供了如下技术方案： 一种从感染疫病的辣椒叶片 中提取胞间液的方法， 其特 征在于： 包括， [0009]培养辣椒叶片并采集、 病原菌侵 染、 冲洗叶片、 吸水纸擦干、 叶片浸入渗透缓冲液， 试管抵压使其浸没、 真空处理、 缓慢打开瓶塞， 待叶片全部吸水后取出， 吸水纸擦干， 封口膜 包裹叶片， 放入注射器中， 离心， 吸取底部液体移至新的离心管， 二次离心， 吸取上清， 超低 温保存样品。 [0010]作为本发明所述提取胞间液方法的一种优选方案， 其中： 所述培养辣椒叶片是在 22～24℃、 光照16 h/黑暗8h的温室中培 养辣椒苗。 [0011]作为本发明所述提取胞 间液方法的一种优选方案， 其中： 所述采集辣椒叶片6周后说　明　书 1/4 页 3 CN 115403651 A 3