(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210711093.3 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 海南大学 地址 570228 海南省海口市美兰区人民大 道58号 (72)发明人 李志刚　纪晓贝　赵震　田野　 缪卫国　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 王美燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原 菌RNA比例的引物及方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于评估被白粉菌侵染 的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法。 本发明 使用两对 新的引物(EqP21001、 EqP21002)对橡胶 树白粉菌不同侵染阶段的cDNA样本进行PCR扩 增， 并通过ImageJ软件对PCR所得凝胶电泳图进 行灰度分析。 结果显示， EqP21002引物最适用于 评估橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段 RNA 相对含量， EqP21001次之。 相较于转录组测序等 方法， 本发明通过半定量PCR分析建立了一种简 便快捷的评估方法用来检测橡胶树白粉菌侵染 橡胶树叶片过程中RNA的比例， 为进一步探索橡 胶树白粉菌与寄主的互作过程 提供便利。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 115125324 A 2022.09.30 CN 115125324 A 1.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物， 其特征在于， 所述引物 为EqP210 01或EqP210 02； 所述EqP21001的上游引物序列为TGCTCTCGTCATAGCAACGG， 下游引物序列为 TCATCGCGTC CAGTCTTCAC； 所述EqP21002的上游引物序列为ACATGTAAGCAAAGCGCACC， 下游引物序列为 AGCGCCGTAATTTTGGCATC。 2.根据权利要求1所述的引物， 其特 征在于， 所述引物为EqP210 02。 3.根据权利要求1所述的引物， 其特 征在于， 所述白粉菌为橡胶树白粉菌 。 4.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 将白粉菌侵染叶片不同阶段的RNA反转录合成cDNA， 使用引物EqP21001或EqP21002对 白粉菌侵染叶片不同阶段的cDNA样 本进行PCR扩增， 获取凝胶电泳图， 对图像进 行处理得到 凝胶电泳灰度图， 进 行灰度分析， 得到各样本条带的相对灰度值； 最后以真菌比例值数据为 横坐标， 以相对灰度值 为纵坐标， 作散点图， 并建立回归直线。 5.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的基因， 其特征在于， 所述基因 的核苷酸序列如序列表中SEQ  ID NO:5或SEQ  ID NO:6所示。 6.权利要求5所述的基因在评估被白粉菌 侵染的叶片中病原菌RNA比例方面的应用。 7.权利要求1所述的引物在评估被白粉菌 侵染的叶片中病原菌RNA比例方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125324 A 2一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物 及方法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 具体涉及一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中 病原菌RNA比例的引物及方法。 背景技术 [0002]橡胶树[Hevea  brasiliensis(Willd.ex  A.Juss.)Muell.Arg.]原产于巴西亚马 逊河下游马拉岳以西地带， 是大戟科、 橡胶树属的一种植物， 主要分布区在南北纬10 °以内。 现在， 我国的橡胶树种植区主要在中国台湾、 福建南部、 广东、 广西、 海南以及云南等区域， 其中海南 地区是国家重点种植区域。 [0003]橡胶树白粉菌(Erysiphe  quercicola)主要侵染叶片正面， 同时也侵染叶片背面、 嫩枝、 嫩梢、 花序， 极少侵染老叶， 是引起橡胶树白粉病的病原真菌， 该病菌更易侵染处于古 铜期和嫩绿期的叶片， 造成叶片蜷缩并落叶， 引起减产和生长减缓。 橡胶树白粉病是我国橡 胶种植区最严重的病害之一， 被列为 “两病一虫 ”(橡胶树白粉病、 橡胶树炭疽病和叶螨)， 是 我国橡胶树 早春时期防治的重点。 [0004]目前， 国内外已经有很多关于橡胶树白粉菌生长发育 的研究。 刘静等人的研究表 明， 温度在23 ‑28℃之间、 pH范围为6 ‑8以及持续的黑暗条件更利于橡胶树白粉菌分生孢子 的萌发， 而湿度对分生孢子的萌发没有明显的影响。 万三连等将橡胶树白粉菌孢子侵染寄 主分为5个关键发育阶段， 橡胶树白粉菌接种后分生孢子开始萌发， 4hpi达到分生孢子萌发 高峰； 8hpi时分生孢子产生芽管， 芽管的顶端细胞逐渐膨大形成附着胞； 附着胞产生垂直于 寄主的侵入钉， 15hpi后侵入钉侵入寄主表皮细胞， 末端膨大形成吸器， 并获取寄主体内营 养； 24hpi后寄主表面产生更多的次生菌 丝； 5dpi产生分生孢子梗。 [0005]橡胶树白粉菌是一种活体营养型的专性寄生真菌， 只能寄生在活体橡胶树叶片 上， 目前没有离体培养的方法。 由于橡胶树白粉菌的这一特性， 在实验室中很难长期保存鲜 活的橡胶树白粉菌菌种， 这不利于我们对其形态学、 生物学以及分子生物学方面的研究， 也 使我们很难确定该菌的分类地位。 而在橡胶树白粉菌的致病机理方面， 分子生物学角度的 研究也因为白粉菌的寄生特性而遇到重重困难。 近些年， 基因表达的定量分析广泛应用于 白粉菌的研究中， 它对揭示白粉菌的致病机理有着重要意义。 在研究基因表达水平时， 用内 参基因来做参照物， 内参基因是一种能在细胞中稳定表达的基因， 用它做参照物的作用是 降低在上样量和上样过程中会出现的实验误差， 确保实验结果的准确 性。 如果使用这种不 稳定表达的内参基因， 对靶基因表达量分析的结果可能会相差甚远。 因此， 选择合适的内参 基因至关重要， 而目前并没有关于 橡胶树白粉菌内参基因的相关研究内容发表。 [0006]随着高通量技术的发展， 新一代测序技术也逐渐被用于转录组分析， 利用转录组 测序(RNA ‑Sequencing,RNA ‑Seq)技术， 我们可以得到细胞或者组织内在某一状态时转录本 的序列信息和表达信息， 但同时这种方法也存在着步骤繁琐、 耗时长和成本高昂等缺点。 半 定量反转录－聚合酶链反应(半定量PCR)是近年来常用的一种简捷、 特异的测定RNA相对含说　明　书 1/5 页 3 CN 115125324 A 3