(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211080370.1 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 薛慧琴 地址 030000 山西省太原市杏 花岭区新民 北街3号省妇幼保健 集体 (72)发明人 薛慧琴　 (74)专利代理 机构 北京智行 阳光知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11738 专利代理师 祖骞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 50/30(2019.01) (54)发明名称 一种用于诊断诱发复发性流产的基因的检 测方法 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 尤其涉及一 种用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 包括一组引物组合和一种质谱仪检测方法。 本发 明通过使用全新的引物组合进行飞行时间质谱 检测， 可以判断出样本中是否存在易患复发性流 产的生物样 本， 并且通过使用飞行时间质谱技术 可以在一个样本管中同时检测生物样品中8个位 点的SNP， 从而判断该生物样品是否为复发性流 产易患样品， 特异性好， 反应灵敏， 检测时间短， 方法简单， 成本低廉， 临床应用价 值高。 权利要求书5页 说明书20页 附图3页 CN 115216538 A 2022.10.21 CN 115216538 A 1.一种用于诊断诱发复发性 流产的基因的检测方法， 其特 征在于， 包括： 步骤S1， 用次氯酸钠清洁实验器材、 超净台、 生物安全柜、 桌面、 地面， 然后用75％乙醇 清洁并用紫外线照射3 0min， 试剂轻微涡旋震荡和离心； 步骤S2， 配制PCR  primer、 配制UEP  primer； 步骤S3， 配制PCR混合液； 步骤S4， 配制SAP混液； 步骤S5， 延伸反应； 步骤S6， 脱盐； 步骤S7， 配置分析仪参数； 步骤S8， 使用分析仪分析样本； 步骤S9， 分析完毕。 2.根据权利要求1所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在 所述步骤S2中， 配置PCR  primer包括： 步骤S201， 将装有PCR  primer干粉的离心管120 00g离心10mi n； 步骤S202， 按照引物自带的nmo l数稀释到10 0 μM； 步骤S203， 混匀离心， 静置10mi n； 步骤S204， 再次混匀离心， 每条引物取2.5 μL混到一 起； 步骤S205， 补水至总体积5 00 μL； 在所述步骤S2中， 配置UEP  primer包括： 步骤S206， 将装有 UEP primer干粉的离心管120 00g离心10mi n； 步骤S207， 按照引物自带的nmo l数稀释到 500 μM； 步骤S208， 混匀离心， 静置10mi n； 步骤S209， 再次混匀离心， 根据UEP线性稀释表格 配制UEP引物mix， 不要加水补足体积； 步骤S210， 取1 μL  UEP mix加到49 μL水中； 步骤S211， 点样： 速度140 ‑160， 打至少两个点； 步骤S212， 观察每条UEP的高度， 最低峰不低于最高峰高度的6 0％； 步骤S213， 调整峰低的UEP引物的体积； 步骤S214， 重复步骤S3 0至步骤S3 3， 直到达到要求， 加水补足体积。 3.根据权利要求2所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在 所述步骤S3中， 配制PCR混合液包括： 试剂 N＝1[ μL] Dnase/Rnase ‑Free Deionized water 0.8 10x PCR Buffer with 20mM MgCl20.5 25mM MgCl20.4 25mM dNTP Mix 0.1 0.5 μM Primer Mix 1 5U/ μl PCR Enzyme** 0.2 5ng/ μL DNA 2 Total volume[ μL] 5权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 115216538 A 2步骤S301， 根据上表配制PCR混合液， 并将PCR混合液加到96孔板中； 步骤S302， 加2 μL DNA在步骤4.2.3.1配制的PCR混合液 里； 步骤S303， 把板用膜封好， 40 00rpm离心5s； 步骤S304， 放于PCR仪进行以下 热循环： 95℃2mi n， 45个循环， 72℃5mi n， 4℃forever。 4.根据权利要求3所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在 所述步骤S4中， 配制SAP混液在冰上的操作包括： 试剂 N＝1[ μL] Dnase/Rnase ‑Free Deionized water 1.53 SAP Buffer 0.17 SAP Enzyme(1.7U/ μL) 0.3 Total volume总体积[ μL] 2 步骤S401， 根据上表配制SAP混合液， 并加2 μLSAP混合液到每一个孔里， 把板用膜封好， 4000rpm离心5s； 步骤S402， 放于PCR仪进行以下程序： 37℃40mi n， 85℃5mi n， 4℃forever。 5.根据权利要求4所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在 所述步骤S5中， 延伸反应在冰上的操作包括： 试剂 N＝1[ μL] Dnase/Rnase ‑Free Deionized water 0.62 iPLEX Buffer 0.2 iPLEX Termination mix 0.2 Extend Primer Mix 0.94 iPLEX Pro Enzyme 0.04 Volume[ μl] 2 步骤S501， 根据上表配制iPlex延伸混液； 步骤S502， 每一个孔加入2μL  iPLEX延伸混合液(加混液后总体积： 9μL)； 把板用膜封 好， 4000rpm离心5s； 步骤S503， 将96孔板放上PCR仪进行以下热循环： 94℃30s， (94℃5s ‑<52℃5s， 80℃5s> x5)x40个 循环， 72℃3mi n， 4℃forever。 6.根据权利要求5所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在 所述步骤S6中， 包括： 步骤S601， 把 洁净树脂(Resin)铺平在垫有白纸的96/15mg  dimple plate上， 风干最少 10min； 步骤S602， 在样本孔里加入41 μL水， 瞬时离心； 步骤S603， 加入15mg洁净树脂(Resin)： 轻轻将样本板凌空反转， 放在盛有树脂的 dimple plate上， 然后将dimple  plate连样本板一起反转(过程中两板不可水平移动)， 使 树脂掉到孔里； 步骤S604， 用膜把板 封好， 放在旋转混匀仪上， 转速10 ‑11， 摇匀40mi n； 步骤S605， 将板以20 00rpm离心5mi n。 7.根据权利要求6所述的用于诊断诱发复发性流产的基因的检测方法， 其特征在于， 在权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 115216538 A 3