(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221076175 0.5 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 广州市林业和园林科 学研究院 地址 510405 广东省广州市白云区广园中 路428号 申请人 浙江省园林植物与花 卉研究所 （浙 江省萧山棉麻研究所） (72)发明人 刘国锋　周琴　史杰玮　马广莹　 包满珠　 (74)专利代理 机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 专利代理师 邓佳 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12N 15/66(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/02(2018.01) A01H 6/20(2018.01) A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称 一种矮牵牛PhS PL9-like转录因子及其应用 (57)摘要 本发明提出了一种矮牵牛PhSPL9 ‑like转录 因子及其应用， 属于基因工程技术领域。 矮牵牛 PhSPL9‑like转录因子， 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示， 其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 本发明通过对PhSPL9 ‑like转录因子 的开发， 不仅揭示矮牵牛开花和花器官大小的调 控机理， 丰富植物的开花和花器官大小理论， 同 时为培养花期和花器官大小适宜的优良花卉品 种提供可能。 权利要求书2页 说明书6页 序列表4页 附图2页 CN 114957425 A 2022.08.30 CN 114957425 A 1.一种矮牵牛PhS PL9‑like转录因子， 其特 征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述矮牵牛PhSPL9 ‑like转录因子的编码蛋白， 其特征在于， 其氨基酸 序列如SEQ  ID NO.2所示。 3.制备如权利要求1所述的矮牵牛PhSPL9 ‑like转录因子所使用的引物对， 其特征在 于， 所述引物对为部分扩增、 全长扩增引物及amicroRNA ‑PhSPL9‑like(amiRNA ‑PhSPL9‑ like)茎环结构扩增引物， 所述部分扩增引物由上游引物PhSPL9 ‑like‑F1、 下游引物 PhSPL9‑like‑R1和上游引物PhSPL9 ‑like‑F2、 下游引物PhSPL9 ‑like‑R2组成； 所述全长扩 增引物由上游引物PhSPL9 ‑like‑F1和下游引物PhSPL9 ‑like‑R2组成； 所述amicroRNA ‑ PhSPL9‑like(amiRNA ‑PhSPL9‑like)茎环结构 扩增引物由上游引物amiRNA ‑PhSPL9‑like‑F 和下游引物amiRNA ‑PhSPL9‑like‑R组成， 其中： 上游引物PhS PL9‑like‑F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 下游引物PhS PL9‑like‑R1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 上游引物PhS PL9‑like‑F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 下游引物PhS PL9‑like‑R2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 上游引物amiRNA ‑PhSPL9‑like‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 下游引物为amiRNA ‑PhSPL9‑like‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 4.一种利用权利要求3所述引物对获得PhSPL9 ‑like转录因子的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： 以矮牵牛不同组织cDNA为模板和 上述PhSPL9 ‑like转录因子的引物对， 进行PCR扩增， 纯化得到PhS PL9‑like转录因子； 其中， PCR体系： 2 ×Taq DNApolymerase  10 μl， 上游引物1 μl， 下游引物1 μl， 模板1 μl， ddH2O 7 μ l， 总共20 μl。 PCR的条件： 98℃预变性， 2min； 98℃， 10s， 55℃， 15s， 72℃， 1min， 35  个循环； 72℃， 1min， 72℃延伸， 10mi n。 5.一种重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体含有权利要求1所述PhSPL9 ‑ like转录因子的植物 表达载体。 6.根据权利要求5所述重组表达载体， 其特 征在于， 所述 植物表达载体为pCAMBIA 2300。 7.一种权利要求5或6所述重组表达载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将目 的片段导入克隆载体 18T中， 然后进行将含目的基因的克隆载体 18T和pCAMBIA2300用Sal  I和Kpn I双酶切进行酶切， 再将得到的目的片段连接到酶切过的 pCAMBIA2300载体上即得到 重组表达载体pCAMBIA 2300‑PhSPL9‑like。 8.一种权利要求5或6所述重组表达载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 利用 microRNA抑制技术， 以PhSPL9 ‑like编码区序列为模板， 获得将要干涉的片段， 并合成 amiRNA‑PhSPL9‑like茎环结构序列扩增的引物， 将载有amiRNA ‑PhSPL9‑like茎环结构序列 的B/C中间载体用KpnI和SalI限制性内切酶进行酶切， 目的片段连接至pCAMBIA2300载体的 相应位点即得到 重组表达载体pCAMBIA 2300‑amiRNA‑PhSPL9‑like。 9.一种含有权利要求5或6所述重组表达载体的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞 为农杆菌GV3101或AGL0 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114957425 A 210.下述各项之一在促进植物开 花和花器官 大小的应用， 其特 征在于， 包括： (1)权利要求1所述矮的牵牛PhS PL9‑like转录因子； (2)权利要求5或6所述的重组表达载体； (3)权利要求8所述的宿主细胞。 11.根据权利要求10所述的应用， 其特 征在于： 所述 植物为拟南芥或矮牵牛。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114957425 A 3