(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607278.X (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 吉林大学 地址 130060 吉林省长 春市前进大街269 9 号 (72)发明人 卢士英　肖毅然　柳溪林　任洪林　 胡盼　李岩松　王洋　王菡　王聪　 郭禹汐　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 刘奇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用 引物对和CRIS PR/Cas12a检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森 氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致 病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂 盒及应用， 属于分子生物学检测技术领域。 本发 明提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔 森氏菌的引物对， 所述引物对包括ail ‑F和ail‑ R， 所述ail ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述ail‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 本 发明所述引物对能够基于CRISPR/Cas12a实现致 病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测， 快速且准确， 灵敏度高， 特异性强。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图7页 CN 115125313 A 2022.09.30 CN 115125313 A 1.一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对， 其特征在于， 所述引物对包 括ail‑F和ail‑R， 所述ail ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述ail ‑R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 2.权利要求1所述引物对在制备检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒中的应 用。 3.一种检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权 利要求1所述引物对和反应 体系。 4.一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所述引物对和特异 性crRNA， 所述crRNA的核苷 酸序 列如SEQ ID NO.3所示。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括RPA扩增试剂和 CRISPR/Cas12a检测试剂。 6.根据权利 要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增试剂包括RPABasic冻干粉、 RPA反应缓冲液和MgOAc 。 7.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括RPA扩增体系， 每50 μL的 RPA扩增体系包括： 4mg  RPA Basic冻干粉， 10μM  ail‑F和ail‑R各2.4μL， RPA反应缓冲液 29.5 μL， 280mM  MgOAc 2.5 μL， 2 μL模板DNA和DEPC水1 1.2 μL。 8.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括 Cas12a酶、 s sDNA荧光猝灭探针和NEBuf fer 3.1。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA荧光猝灭探针为在如SEQ  ID  NO.4核苷酸序列5 ’端标记有6 ‑FAM且3’标记有BHQ ‑1的物质。 10.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括CRISPR/Cas12a检测体 系， 每20μL的CRISPR/Cas12a检测体系包括： 1μM  Cas12a酶2μL， 1μM  crRNA 2μL， NEBuffer3.12 μL， 5 μM  ssDNA荧光猝灭探针2 μL， RPA扩增产物 2 μL和DEPC水10 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125313 A 2一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRI SPR/ Cas12a检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域， 具体涉及 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏 菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试 剂盒及应用。 背景技术 [0002]致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenic  Yersinia  enterocolitica)是一类 重要的食源性致病菌， 小肠结肠炎耶尔森菌能够在低 温下增殖。 人感染后可引起胃肠道症 状、 呼吸系统、 心血管系统等疾病， 甚至引起急性阑尾炎、 败血症。 近年来， 由致病性小肠结 肠炎耶尔森氏菌引起的耶尔森氏菌病在全球广泛流行， 其中欧洲最为严重， 我国在20世纪 80年代也遭受过2次由耶尔森氏菌病引起的大流行。 根据欧洲食品安全局(EFSA)2015年的 一份报告， 耶尔森菌病 是欧洲最重要的食源性人畜共患病之一。 在上世纪80年代中期我国 证实有两次大 的暴发流行， 造成五百多人感染， 其原因均为食物污染致病性小肠结肠炎耶 尔森氏菌引起的。 在动物屠宰加工过程、 运输、 销售过程中都可能使肉产品受到污染， 包括 乳汁也可能被致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌 污染。 [0003]传统的细菌检测技术包括病原分离培养、 生化鉴定、 血清学诊断等， 作为检测的 “金标准”国标方法已经臻于完善且标准化。 但耗时长， 单次检出量有限， 并因含量低， 常规 方法灵敏度较难检出。 P CR相关方法需经电泳后成像才能读取结果， 易因操作不当污染而产 生假阳性、 费时等缺陷。 中国食品安全国家标准GB  4789.8‑2016中规定的食品中小肠结肠 炎耶尔森氏菌的鉴定方法有冷富集、 培养基培养、 尿素酶试验、 半固体动力试验、 革兰氏染 色镜检和生化鉴定。 这些方法通常与PCR等核酸扩增方法结合使用， 导致依赖大型仪器， 反 应时间长。 实际应用上仍待开发灵敏度高， 操作简便， 实用性强的快速检测技术。 为了减少 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的危害， 亟待一种检测时间短， 灵敏度高， 特异 性强的检测方 法。 [0004]CRISPR/Cas12a受单链RNA(crRNA)引导， 特异 性结合靶DNA后，  Cas12a的结构变化 激发其酶活性， 不仅可以顺式切割靶 标DNA， 还 可以反式切割非靶标DNA。 基于Cas12a的检测 成功应用于人乳头瘤病毒(HPV)  的检测， 在之后的几年中基于Cas12a的检测层出不穷。 2019年复旦大学开发出基于CRISPR/cas12的快速可视化核酸检测平台， 解决了气溶胶污染 的问题。 同一年， Cas12a被用于开 发电化学生物传感器不仅提高了灵敏度还增强了便携性。 这种传感器被命名为E ‑crispr， 它使低成本医疗诊断成为可能。  2020年新冠爆发， Cas12a 被应用于新型冠状病毒的检测。 所以从广度上  Cas12a可以检测细菌， 病毒， 肿瘤标志物 等， 从深度上可以比其他方法更精 准， 灵敏的完成检测。 然而CRISPR/Cas12a检测还未应用于检 测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌 。说　明　书 1/8 页 3 CN 115125313 A 3