(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211316421.6 (22)申请日 2022.10.26 (71)申请人 安徽农业大 学 地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西 路130号 (72)发明人 盛成旺　卢静波　沈伟宏　廖敏　 蒋兴川　操海群　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/44(2006.01) (54)发明名称 一种草地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶A201S和 F290V突变检测方法及应用 (57)摘要 本发明基于环介导等温扩增技术 （LAMP） 建 立一种草地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶A201S和F290V 突变快速检测方法， 属于害虫抗药性分子检测和 草地贪夜蛾综合防治范畴。 本发 明检测方法通过 在草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V位点 分别设计2对特异性引物， 进行LA MP扩增， 根据反 应产物颜色判定是否为草地贪夜蛾乙酰胆碱酯 酶A201S和F290V突变个体。 该方法稳定性高、 耗 时短、 操作简便、 灵敏度高， 适合田间快速检测草 地贪夜蛾对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗药 性的分子检测， 为草地贪夜蛾综合防治提供了决 策依据。 权利要求书2页 说明书6页 附图5页 CN 115491425 A 2022.12.20 CN 115491425 A 1.一种基于环介导等温扩增技术 （LAMP） 对草地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突 变检测的引物组合， 其特 征在于， 所述引物组合包括内引物FIP/BIP和外引物F3 /B3， 所述内引物FIP/BIP序列分别为: FIP‑A201S： TCGATAGAG GTGACAATAAATGCAAAACATTATTCGGTGAGTCGT （SEQ  ID NO.1） BIP‑A201S： AACTTGTTCTCTCAG GCGATAATGTCAAAATGCTTTCTTCTCTTGA （SEQ ID NO.2） FIP‑F290V： GCTCATCTAG GAACGAACCATCTAGGAACTCTTGGTATTTGTGAAG （SEQ ID NO.5） BIP‑F290V： TACCCGCTCGATCAT TAGCAGTAGTA ACCTTCCTCCGTATT （SEQ ID NO.6） 所述外引物F3 /B3序列分别为: F3‑A201S： TACT TCGGAGGAAACCCG （SEQ ID NO.3） B3‑A201S： TTCTGCTAATCGGATGCC （SEQ ID NO.4） F3‑F290V： GATGA ACTAGTCA ATAATGAATGG （SEQ ID NO.7） B3‑F290V： CCTTGGGGAATAACTCAGT （SEQ  ID NO.8） 。 2.一种基于环介导等温扩增技术 （LAMP） 对草地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突 变检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： （1） 提取草 地贪夜蛾幼虫或 成虫基因 组DNA， 制备gDNA模板； （2） 在反应容器中建立LAMP反应体系， 包括LAMP反应液、 特异性引物， gDNA模板， 并补充 无菌水； （3） 将LAMP反应 体系放入恒温容器中进行恒温孵 育反应； （4） 结果判定： 反应结束后， 反应液不变色的样品为非突变体， 反应液变色的样品为突 变体； 其中所述特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3， 所述内引物FIP/BIP序列分 别为: FIP‑A201S： TCGATAGAG GTGACAATAAATGCAAAACATTATTCGGTGAGTCGT （SEQ  ID NO.1） BIP‑A201S： AACTTGTTCTCTCAG GCGATAATGTCAAAATGCTTTCTTCTCTTGA （SEQ ID NO.2） FIP‑F290V： GCTCATCTAG GAACGAACCATCTAGGAACTCTTGGTATTTGTGAAG （SEQ ID NO.5） BIP‑F290V： TACCCGCTCGATCAT TAGCAGTAGTA ACCTTCCTCCGTATT （SEQ ID NO.6） 所述外引物F3 /B3序列分别为: F3‑A201S： TACT TCGGAGGAAACCCG （SEQ ID NO.3） B3‑A201S： TTCTGCTAATCGGATGCC （SEQ ID NO.4） F3‑F290V： GATGA ACTAGTCA ATAATGAATGG （SEQ ID NO.7） B3‑F290V： CCTTGGGGAATAACTCAGT （SEQ  ID NO.8） 。 3.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测方法， 其特 征在于， 步骤 （2） 中， 所述 LAMP反应液包括2 WarmStar t LAMP预混液。 4.根据权利要求3所述的草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变体检测方法， 其 特征在于， 所述LAMP反应体系包括LAMP反应液包括2 WarmStart  LAMP预混液试剂  12.5 μ L、 gDNA模板1.0  μL、 内引物FIP/BIP和外引物F3/B3混合液2.5  μL、 用无菌水补足2 5 μL反应 体系。 5.根据权利要求4所述的草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测方法， 其特 征在于， 所述内引物FIP/BIP的浓度为1.0 ‑2.0 μmol·L‑1； 所述外引物F3/B3的浓度为0.2 ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115491425 A 21.0 μmol·L‑1。 6.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测方法， 其特 征在于， 步骤(3)中， 恒温孵 育反应加热温度为6 0~70℃， 加热时间为20~60 min。 7.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测方法， 其特 征在于， 步骤(4)中， 所述含A201S或F290V突变的反应溶液的颜色变化为黄色， 所述不含 A201S和F2 90V突变的反应溶 液的颜色仍 为粉色。 8.一种草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒中含有权利要求1所述的引物组合。 9.一种草地贪夜蛾 乙酰胆碱酯酶A201S和F290V突变检测试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒包括提取草地贪夜蛾幼虫或成虫基因组DNA提取试剂、 LAMP反应液、 权利要求1所述的 引物组合。 10.权利要求9 ‑10任一检测试剂盒在检测草地贪夜蛾防治中的应用， 其特征在于， 利用 检测试剂盒检测草 地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶A 201S和F2 90V突变。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115491425 A 3