(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210623852.0 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 吉林农业大 学 地址 130118 吉林省长 春市南关区新城大 街2888号 (72)发明人 田恩静　谢晓梅　段仁和　曹广乘　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 戴嵩玮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引物、 检 测试剂盒和物种鉴定方法 (57)摘要 本发明提供了一种赭鹿花菌分子身份证及 其扩增引物、 检测试剂盒和物种鉴定方法， 属于 物种鉴定技术领域。 本发明基于DNAmini ‑ barcode技术开发出一种赭鹿花菌分子身份证， 可有效鉴定赭鹿花菌物种， 并且 具有超高的检测 灵敏度。 本发 明还基于赭鹿花菌分子身份证设计 得到一对特异性引物， 利用所述引物进行检测， 可大大的降低了误食赭鹿花菌的检测时间和成 本， 且操作便利。 可见本发明提供鉴定方法为蘑 菇中毒事件的现场快速实时检测提供了基础， 同 时进一步完善了蘑菇产品质量与安全的监督检 测体系。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114774580 A 2022.07.22 CN 114774580 A 1.一种赭鹿花菌分子身份证， 其特征在于， 赭鹿花菌分子身份证的核苷酸序列如SEQ   ID NO:1所示或与SEQ  ID NO:1互补的序列。 2.一种特异性扩增权利要求1所述赭鹿 花菌分子身份证的引物， 其特征在于， 包括核苷 酸序列如SEQ  ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的反向引物。 3.一种鉴定赭鹿花菌的检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求2所述引物和检测试 剂。 4.根据权利要求3所述检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂包括PCR扩增用试剂。 5.根据权利要求3或4所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括阳性标准 品； 所述阳性标准品为权利要求1所述 赭鹿花菌分子身份 证。 6.一种赭鹿花菌的物种鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待检测样本的基因 组DNA； 2)以步骤1)中所述基因组DNA为模板， 用权利要求2所述引物进行PCR扩增， 得到PCR产 物； 3)将所述PCR产物进行电泳和 测序， 得到12 2bp的序列判断待检测样本为 赭鹿花菌 。 7.根据权利要求6所述物种鉴定方法， 其特征在于， 步骤2)中PCR扩增的反应体系总体 系为25 μL， 包括12.5 μL的2 ×Taq PCR Master Mix12.5 μL， 2 μM 上游引物和2 μM 下游引物各 1 μ L， 2 μL10ng/ μLDNA模板， 余 量的ddH2O。 8.根据权利要求6所述物种鉴定方法， 其特征在于， 步骤2)中PCR扩增的反应程序为94 ℃4min； 94℃40s， 5 5℃30s， 72℃3 0s， 34个循环； 72℃10mi n。 9.权利要求1所述赭鹿花菌分子身份证、 权利要求2所述引物或权利要求3～5任意一项 所述检测试剂盒在鉴别赭鹿花菌和近缘种中的应用。 10.根据权利要求9所述应用， 其特征在于， 所述近缘种包括以下一种或几种： 鹿花菌、 大鹿花菌、 弹性马鞍菌、 羊肚菌、 波地钟菌、 胶陀螺和粗柄马鞍菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774580 A 2一种赭鹿花菌分子身份证 及其扩增引物、 检测试剂盒和物种 鉴定方法 技术领域 [0001]本发明属于物种鉴定技术领域， 具体涉及一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引 物、 检测试剂盒和物种鉴定方法。 背景技术 [0002]赭鹿花菌(Gyromitra  infula(Schaeff.)Qu él.)是一种易被误食的有毒蘑菇， 在 我国不同地区夏秋季均有分布， 与可食用的马鞍菌(粗柄马鞍菌Helvella  macropus (Pers.)P.Karst.)极为相似， 易与其混淆发生误食中毒。 它含有鹿花菌素和水解产物甲基 联胺， 可溶解和破坏红细胞， 进而引起急性溶血。 赭鹿花菌中毒事件一旦发生， 快速检测和 鉴定赭鹿花菌对于蘑菇中毒事件的调查、 中毒患者的救助就会显得尤为重要和迫切(李海 蛟等， 2020)。 [0003]蘑菇中毒在临床治疗和法医学分析过程中， 需要从剩余物、 煮熟的蘑菇、 呕吐物或 者胃提取物中取得样本用于检测。 由于高温、 高压和胃液的消化会引起DNA的降解和碎片化 (Goldstein  and Desalle,2 003)。 Meusnier等人 发现COI序列中短于2 50bp的基因片段鉴定 成功率在90％以上， 因此提出使用 “mini‑barcode”的方法来解 决处理过后的样品DNA降解 问题。 随后， 越来越多的研 究学者表明短于300bp的基因片段不会影响对降解的DNA的检测 反而比全长的基因序列更容易扩增。 目前基于DNA  mini‑barcode技术， 韩 建萍课题组首次 提出了中药材分子身份证的概念。 分子身份证指一段极短(20 ‑50bp)且物种特异的DNA序 列， 该序列仅存在于目标物种的基因组中， 用于鉴定混合DNA样品中的某种特定样品。 由于 分子身份证技术具有鉴定效率高、 特异 性强等特征， 因此， 非常适用于有毒蘑菇的鉴定及快 速检测。 [0004]然而分子身份证越段其携带的特异性的DNA分子信息越少， 对成功准确鉴定物种 越困难。 目前尚未有关于准确表征赭鹿花菌的分子身份 证的报道。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引 物、 检测 试剂盒和物种鉴定方法， 可以快速准确 地检测中毒事件中的有毒蘑菇是否含有赭鹿花菌， 为后续快速治疗提供依据。 [0006]本发明提供了一种赭鹿花菌分子身份证， 赭鹿花菌分子身份证的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示或与SEQ  ID NO:1互补的序列。 [0007]本发明提供了一种特异性扩增所述赭鹿花菌分子身份证的引物， 包括核苷酸序列 如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的反向引物。 [0008]本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的检测试剂盒， 包括所述引物和检测试剂。 [0009]优选的， 所述检测试剂包括PCR扩增用试剂。 [0010]优选的， 所述检测试剂盒还 包括阳性标准品；说　明　书 1/6 页 3 CN 114774580 A 3