(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210947441.7 (22)申请日 2022.08.09 (71)申请人 甘肃农业大 学 地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村1 号 (72)发明人 廖伟彪　李昌霞　侯雪梅　李翊华　 张红升　 (74)专利代理 机构 北京盛凡佳华专利代理事务 所(普通合伙) 11947 专利代理师 华小明 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/113(2010.01) A01H 5/08(2018.01) A01H 6/82(2018.01)C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方 法 (57)摘要 本发明提供一种通过基因编辑延缓番茄果 实成熟的方法， 利用CRISPR/Cas9系统对番茄材 料基因组 中的转录因子SlNAP1进行编辑， 进而使 转录因子SlNAP1性能丧失， 从而延缓番茄 果实成 熟； 所述CRISPR/Cas9系统包括两个sgRNA靶位 点， 分别命名为sgRNA1和sgRNA2； 所述sgRNA1和 所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄材料基 因组中编码SlNAP1蛋白的DNA片段。 本发明获得 一个SlNAP1敲除株系， 并发现SlNAP1基因能正调 控番茄果实成熟。 抑制SlNAP1在番茄 果实中的表 达， 能延缓绿熟期果实叶绿素的降解和转色期果 实类胡萝卜素的积累， 从而延缓果实成熟的进 程。 权利要求书2页 说明书10页 附图5页 CN 115261405 A 2022.11.01 CN 115261405 A 1.一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法， 其特征在于： 利用CRISPR/Cas9系统对 番茄材料基因组中的转录因子SlNAP1进行编辑， 进而使转录因子SlNAP1性能丧失， 从而延 缓番茄果实成熟； 所述CRIS PR/Cas9系统包括两个sgRNA靶位 点， 分别命名为sgRNA1和sgRNA 2； 所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄材料基因组中编码SlNAP1蛋白 的DNA片段。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 所述sgRNA1靶位 点序列为： CTGATCT TCCTCCTGGATTT； 所述sgRNA 2靶位点序列为： CAGA ATTTGGAGACAATGAG。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于： 所述编辑的方法为向所述番茄材料中 导入番茄基因组编辑的载体； 所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1靶位点序列、 所述sgRNA2靶位点序列的编 码基因； 作为优选， 所述方法还 包括筛选SlNAP1纯合 突变体的步骤。 4.SlNAP1基因在调控番 茄果实成熟中的应用； 作为优选， 所述调控为 正调控。 5.一种晚熟番茄材料的获得方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 将权利要求1 ‑4任一所 述方法获得的番茄材料自交， 得到自交子代， 选择SlNAP1纯合突变且不携带外源DNA片段的 自交子代， 即为晚熟番 茄材料。 6.权利要求5所述的方法在培 育晚熟番 茄材料中的应用。 7.如下(1) ‑(3)中任一种生物材 料： (1)权利要求1中所述的靶位 点序列； (2)权利要求3中所述的番 茄基因组编辑的载体； (3)含有权利要求3中所述的番 茄基因组编辑的载体的微 生物转化体。 8.权利要求7所述的载体或微生物转化体或靶位点序列在延缓番茄果实成熟性 能中的 应用； 或， 权利要求7所述的载体或微生物转化体或靶位点序列在培育晚熟番茄材料中的应 用； 或， 权利要求7 所述的载体或微 生物转化体或靶位 点序列在番 茄育种中的应用。 9.一种鉴定待测番茄是否为权利要求1 ‑4任一所述方法获得的晚熟番茄材料或其子代 的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 分别提取番茄野生株和待测番茄转化株基因组DNA， 以上游引物和下游引物对番茄野 生株和待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增， 分别得到PCR扩增产物， 根据所述PCR扩增产物 测序结果， 判断待测番茄是否为上述方法获得的延缓果实成熟 的番茄材料或其子代， 判断 方法为将转化株测序结果与野生型植株测序结果进行比对， 如果在sgRNA1、 sgRNA2附近或 二者之间出现碱基的缺失或插 入， 即可判断其 为上述方法获得的晚熟番 茄或其子代； 所述上游引物： CTA AAATTTCATTTTCTCTC 所述下游引物： GATA ATATGTGTCT TAAGTA。 10.一种鉴定或鉴定待测番茄是否为权利要求1 ‑4任一所述方法获得的晚熟番茄材料 或其子代的产品， 为如下(1) ‑(3)中的任一种：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261405 A 2(1)权利要求9中所述的上游引物和下游引物； (2)含有(1)所述的上游引物和下游引物的PCR试剂； (3)含有(1)所述的上游引物和下游引物或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261405 A 3