(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210622113.X (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 上海市农业科 学院 地址 201106 上海市闵行区北翟路2 901号 (72)发明人 刘建雨　尚晓冬　谭琦　宋春艳　 王瑞娟　陆欢　于海龙　杨慧　 徐珍　付阳　 (74)专利代理 机构 上海容慧专利代理事务所 (普通合伙) 31287 专利代理师 张竹梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种金针菇褐化病毒鉴定用引物探 针 (57)摘要 本发明公开了一种金针菇褐化病毒鉴定用 引物探针， 其由SEQ  ID No.1和SEQ  IDNo.2所示 的引物对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针组成。 本 发明还公开了一种金针菇褐化病毒的鉴定方法。 本发明的金针菇褐化病毒鉴定用引物探针为生 产上早期筛选无褐化病毒的金针菇菌种以及鉴 定采收期金针菇子实体病毒提供技 术支持。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114807450 A 2022.07.29 CN 114807450 A 1.一种金针菇褐化病毒鉴定用引物探针， 其由SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所示的引物 对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针组成。 2.根据权利要求1所述的金针菇褐 化病毒鉴定用引物探针， 其 中探针序列SEQ  ID No.3 的5’端添加FAM荧 光基团， 3 ’端添加BHQ猝灭基团。 3.一种金针菇褐化病毒鉴定的试剂盒， 所述试剂盒包括SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所 示的引物对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针。 4.根据权利要求3所述的金针菇褐 化病毒鉴定的试剂盒， 其 中探针序列SEQ  ID No.3的 5’端添加FAM荧 光基团， 3 ’端添加BHQ猝灭基团。 5.一种金针菇褐化病毒的鉴定方法， 所述 鉴定方法包括如下步骤： (1)金针菇粗 提液的制备； (2)利用核酸 提取试剂从金针菇粗 提液中提取病毒RNA； (3)加入SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所示的引物对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针 组合 进行两步法qRT ‑PCR核酸扩增反应， 其中引物终浓度为0.2 μM， 探针终浓度为0.2 μM； (4)根据Ct值判断是否是 金针菇褐化病毒。 6.根据权利 要求5所述的金针菇褐化病毒的鉴定方法， 其中所述两步法qRT ‑PCR核酸扩 增反应的反应条件为： 第一 步： 94℃， 5分钟； 第二 步:94℃， 5秒钟、 6 0℃， 30秒钟， 40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807450 A 2一种金针菇褐化病毒鉴定用引物探针 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体的说涉及一种金针菇褐化病毒鉴定用引物探针。 背景技术 [0002]在金针菇工厂化生产 中， 病害防控是栽培过程中的技术难点。 褐化病毒会引起金 针菇菌丝生长变慢， 子实体品质和产量降低， 严重影响企业效益。 因此， 对主栽金针菇进行 病毒检测和鉴定， 及时检测出带病毒菌株， 对优化市场种质资源， 菌种质量评估， 确保采后 金针菇品质等具有重要意 义。 [0003]而目前金针菇褐化病毒检测和鉴定仍然是业界的难点， 也是制约产业发展的重 点。 目前报道的对金针菇褐化病毒的检测方法通常是普通PCR法， 该方法费时长， 检测结果 不灵敏， 容 易出现假阳性或假阴性。 [0004]因此， 需要研究开发一种新的金针菇病毒鉴定方法。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是， 针对现有技术不足， 提出一种针对金针菇菌丝和子 实体的鉴定褐化病毒用的引物探针以及其 鉴定方法。 [0006]本发明的目的首先在于提供一种金针菇褐化病毒鉴定用引物探针， 其由SEQ  ID  No.1和SEQ ID No.2所示的引物对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针组成； [0007]其中所述的引物对和探针序列是针对金针菇褐化病毒(Browning  virus)FvBV的 外壳蛋白CP1基因(NCBI登录号AB46 5309)设计的； [0008]具体的说， 探针序列SEQ  ID No.3的5’端添加FAM荧光基团， 3 ’端添加BHQ猝灭基 团。 [0009]本发明的另外一个目的在于提供一种金针菇褐化病毒鉴定的试剂盒， 所述试剂盒 包括上述SEQ  ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对， 以及SEQ  ID No.3所示的探针； [0010]其中探针序列SEQ  ID No.3的5’端添加FAM荧 光基团， 3 ’端添加BHQ猝灭基团。 [0011]优选的， 所述试剂盒用于： [0012]鉴定或辅助鉴定待测病毒为金针菇褐化病毒。 [0013]本发明的另外一个目的在于提供一种金针菇褐化病毒的鉴定方法， 所述鉴定方法 包括如下步骤： [0014](1)金针菇粗 提液的制备； [0015](2)利用核酸 提取试剂从金针菇粗 提液中提取病毒RNA； [0016](3)加入S EQ ID No.1和SEQ  ID No.2所示的引物对， 以及S EQ ID No.3所示的探针 组合进行两步法qRT ‑PCR核酸扩增反应， 其中引物终浓度为0.2 μM， 探针终浓度为0.2 μM； [0017](4)根据Ct值判断是否是 金针菇褐化病毒； [0018]其中步骤(4)中， Ct值小于 38的判断为阳性； [0019]其中所述两步法qRT ‑PCR核酸扩增反应的反应条件为： 第一步： 94℃， 5分钟； 第二说　明　书 1/5 页 3 CN 114807450 A 3