(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210647929.8 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 河南中烟工业有限责任公司 地址 450000 河南省郑州市郑东 新区榆林 南路16号 (72)发明人 田涛　杨永锋　马一琼　王召军　 刘茂林　芦昶彤　杨欣玲　 (74)专利代理 机构 北京维澳专利代理有限公司 11252 专利代理师 隋勤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定烟草腺毛密度的DNA分子标记及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定烟草腺毛密度的分 子标记及其应用， 该鉴定烟草腺毛密度的分子标 记的引物包括： 上游引物W12 ‑seq‑F： 5’‑ GACAGGGGAGATTATTCAAAA ‑3’； 上游引物W12 ‑WT‑ F： 5’ ‑CACCACGAGTGATCAACCACC ‑3’； 公共下游引 物W12‑R： 5’ ‑TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG ‑3’。 本申 请的引物可以较为精确的鉴定待测烟株的腺毛 密度， 省去烟株叶面腺毛观察， 减少表型鉴定的 工作量； 可以在烟株发育早期进行鉴定， 只对中 选单株进行大田移栽， 减少田间种植工作量及种 植成本； 能够同时进行测序及琼脂糖凝胶电泳检 测， 两种方法可以相互验证， 增 加鉴定的准确度。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115011721 A 2022.09.06 CN 115011721 A 1.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物， 其特征在于， 所述引物包括以下上游引 物和下游引物： 上游引物W12 ‑seq‑F： 5’ ‑GACAGGGGAGATTATTCAAAA‑3’； 上游引物W12 ‑WT‑F： 5’ ‑CACCACGAGTGATCA ACCACC‑3’； 公共下游引物W12 ‑R： 5’ ‑TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG‑3’。 2.一种包 含权利要求1所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物的试剂盒。 3.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)引物组合成： 合成如权利要求书1所述的引物W12 ‑seq‑F、 W12‑WT‑F以及W12 ‑R； (2)DNA的提取： 提取烟草叶片的基因 组DNA； (3)PCR扩增： 基于上述烟草叶片基因组DNA， 使用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增， 引 物组合分别为W12 ‑seq‑F+W12‑R和W12‑WT‑F+W12‑R， 预先加入两个已经确定为高腺毛密度 和低腺毛密度且基因序列已知的样本DNA作为对照； (4)扩增产物检测与分析： 直接测序： 对于W12 ‑seq‑F+W12‑R引物组合扩增的产物， 直接进行测序， 若所测DNA片段 135‑141bp位置的7 ‑bp缺失， 即与SEQ  ID NO.4序列相同， 则为高腺毛密度单株； 若所测DNA 片段135‑141bp位置的没有缺失， 即与SEQ  ID NO.5序列相同， 则为低腺毛密度单株； 若测序 峰图为套峰， 为低腺毛密度单株； 琼脂糖凝胶检测： 对于W12 ‑WT‑F+W12‑R引物组合的扩增产物进行琼脂糖凝胶检测， 若 W12‑WT‑F+W12‑R引物组合不 能扩增出条带， 则为高腺毛密度 单株； 若W12 ‑WT‑F+W12‑R引物 组合能扩增出 条带， 则为低腺毛密度单株。 4.根据权利要求3所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记 的方法， 其特征在于， 步骤(3) 中PCR扩增反应体系为： 50ng/ μL的样品基因组DNA模板1.0 μL， 2 ×EASY Taq mix 10 μL， 10 μM 的上下游引物各0.4 μL， d dH2O补足至20 μL。 5.根据权利要求3所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记 的方法， 其特征在于， 步骤(3) 中PCR扩增程序为： 9 5℃预变性5min， 然后9 5℃ 30s， 57℃ 30s， 72℃  30s， 共35个循环， 最后 72℃ 10min。 6.一种根据权利要求1所述的引物、 根据权利要求2所述试剂盒或根据权利要求3 ‑5任 一所述的方法在 烟草育种中的应用。 7.一种根据权利要求1所述的引物、 根据权利要求2所述试剂盒或根据权利要求3 ‑5任 一所述的方法在筛 选烟草不同腺毛密度单株中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011721 A 2一种鉴定 烟草腺毛密度的DNA分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 特别涉及一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记及 其应用。 背景技术 [0002]烟草是我国重要的经济作物， 烟草表面密布表皮毛， 根据表皮毛形态特征及是否 具有分泌能力， 可分为 三种类型： 长柄腺毛、 短柄腺毛和非分泌型表皮毛。 [0003]烟草腺毛具有 旺盛的分泌能力， 能够合成并分泌多种次生代谢产物， 在烟株应对 环境胁迫中发挥着重要作用。 腺毛分泌物可以在烟株表面形成一层连续而黏稠的膜状物， 阻碍昆虫移动， 导致其饥饿、 窒息死亡。 此外腺毛分泌物中的二萜类物质及蔗糖酯对蚜虫都 有毒杀作用； 在应对病原微生物方面， 烟草短柄腺毛分泌的抗性蛋白Ph ylloplanins可以抑 制烟草霜霉菌(Peronospora  tabacina)孢子囊和分生孢子的萌发， 从而保护烟草免受其侵 袭。 [0004]烤后烟叶香气品质是烤烟最重要的性状， 腺毛分泌物对烟叶品质也具有重要影 响。 烤烟腺毛分泌物主要为类西柏烷二萜 化合物和蔗糖脂， 二者 都是重要的致香前体物质。 类西柏烷化合物主要由α和β ‑型西柏三烯一醇(CBT ‑ol)和西柏三烯二醇(CBT ‑diol)及其同 分异构体组成， 该类物质调制后大部分降解， 主要产 物是茄酮及其衍生物， 茄酮 本身具有很 好的香气， 而其转化产物如茄醇、 茄尼呋喃、 降茄二酮等也是重要的香味物质。 蔗糖酯与烟 草吸味的丰满度相关， 在卷烟的燃吸过程中， 蔗糖酯通过热解产生低分子挥发性的酸和酯， 如异丁酸， 3 ‑甲基丁酸和 3‑甲基戊酸等， 可赋予卷烟香料烟烟气特有的香气； 此外， 糖酯还 具有保湿、 保润、 保香 等作用。 [0005]综述所述， 提高烟草腺毛密度将有效增强烟株对环境胁迫的抗性， 并提高烟叶的 香气品质， 因此提高腺毛密度是烟草育种的重要目标之一。 然而， 由于烟草腺毛密度受到栽 培手段、 生态条件等诸多环境因素的影响， 加之腺毛 形态较小， 需要显微观察才能进 行有效 筛选， 因此极大限制 了采用常规育种手段进行烟草腺毛性状的改良。 现代生物技术的发展 为烟草腺毛表型鉴定提供了一种 快速有效的方法——DNA分子标记， 通过开发与腺毛密度 紧密连锁的分子标记， 只需要少量的基因组DNA即可实现对腺毛密度的精准选择。 由于烟株 任何组织 都具有相同的基因组成， 因此只可以在烟株发育任何时期采集极少量的组织即可 完成鉴定， 避免了对待选单株的破坏性取样， 并能实现早期筛 选。 [0006]本研究团队前期在烟草EMS诱变群体中发现了一株腺毛密度显著提高的突变体， 进一步研究发现该突变体基因组发生了一段7碱基的缺失， 是造成该单株出现多腺毛表型 的原因。 因此该突变体可以作为高腺毛密度的供体亲本， 通过针对该7碱基缺 失突变开 发分 子标记， 可以有效提高筛 选效率， 对烟草高腺毛育种具有重要的应用价 值。 发明内容 [0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记及其应用，说　明　书 1/6 页 3 CN 115011721 A 3