(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210771139.0 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 河北农业大 学 地址 071001 河北省保定市莲池区灵雨寺 街289号 申请人 河北省兽药饲料工作总站(河北省 畜产品质量检验监测中心) 　 河北省畜牧良种工作总站 （河北省 种畜禽质量 监测站） (72)发明人 周荣艳　李媛媛　刘华格　陈辉　 王文君　倪慧勇　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 田立媛(51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定鸡金银羽性状分子标记的KASP引 物组及应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定鸡金银羽性状分子 标记的KASP引物组及应用。 属分子标记育种技术 领 域 。 引 物 组 的 核 苷 酸 序 列 ：5 ’‑ GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTCTTTGGA TGGATGGCTT T C C‑3’；S E Q I D N o . 1 ；5 ’‑ GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCT CTTTGGATGGATGGCT T T C A ‑3’；S E Q I D N o . 2 ；5 ’‑ CCCATGAAATCCGTGAAGAAGAGCAT ‑3’； SEQIDNo.3。 本发明利用KASP进行鸡金银羽基因型检测， 对 DNA样本需求低， 适于 大批量样本检测， 准确性达 100％， 支持低、 中或高通量研究及单个重复实 验。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115141891 A 2022.10.04 CN 115141891 A 1.一种鉴定鸡金银羽性状分子标记的KASP引物组， 其特征在于， 所述KASP标记引物组 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示； 5’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTC CTCTTTGGATGGATGGCTTTCC‑3’； SEQ ID No.1； 5’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAC CTCTTTGGATGGATGGCTTTCA‑3’； SEQ ID No.2； 5’ ‑CCCATGAAATCCGTGAAGAAGAGCAT‑3’； SEQ ID No.3。 2.如权利要求1所述的KAS P引物组的应用， 其特 征在于， 选自以下任一应用： (1)在鸡分子标记辅助育种中的应用； (2)在鸡金 银羽性状鉴定中的应用； (3)在雏鸡性别鉴定中的应用。 3.一种鉴定鸡金银羽性状的KASP检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利 要求1所述的KASP 引物组。 4.一种鉴定鸡金银羽性状的方法， 其特征在于， 采用如权利要求1所述的KASP引物 组通 过KASP技术进行PCR反应和荧 光检测； 若仅检测到FAM荧 光即为金羽基因纯合子， 记为C C； 若仅检测到 HEX荧光即为银羽基因纯合子， 记为A A； 若同时检测到FAM和H EX信号， 则为银羽杂合子， 记为AC 。 5.如权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)根据鸡金银羽控制 基因位点设计KASP引物组， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID  NO.2和SEQ  ID NO.3所示； (2)建立PCR体系： 包括5 μL DNA、 5 μL KASP Master Mix和KAS P引物组； 其中KASP标记引物组用量 为0.14 μL； (3)设置空白对照： 将PCR体系中的DNA以等 量的ddH2O代替， 以作为空白对照； (4)进行PCR扩增： 扩增程序如下： 94℃预变性15mi n， 94℃变性20s， 5 5‑61℃退火和延伸6 0s， 进行10个 循环； 94℃变性20s， 5 5℃退火和延伸6 0s， 进行2 9个循环； (5)得到金 银羽控制基因的分型 结果。 6.如权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 步骤(2)中所述DNA来源于鸡血 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141891 A 2一种鉴定鸡金银羽性状分子标记的KASP引物组及应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子标记育种技术领域， 更具体的说是涉及 一种鉴定鸡金银羽性状分 子标记的KAS P引物组及应用。 背景技术 [0002]鸡的羽色具有多样性， 大致可分为黑、 麻、 白三种类型， 是最直观的品种特征。 可作 为鸡育种中的一项重要选择指标， 不仅拥有一定的观赏价值， 还拥有一定的经济效益。 早期 的研究发现家鸡的金色和银色羽毛是 由性染色体Z上的S基因座决定的。 S基因座包括一系 列等位基因， 银色S为显性伴性基因， 金黄 色s为隐性伴性基因， Sal为性连锁 不完全白化， 其 显隐性的关系为S>s>Sal。 金色基因控制的羽色在雏鸡绒毛表现为黄 色或棕黄色， 而 银色基 因控制的羽色在雏鸡绒毛表现为浅灰色或白色， 银羽(silv er， S)基因作为一个性连锁羽色 位点， 已被广泛应用于家禽 生产中的性别鉴定 。 [0003]研究表明， 黑色素和类胡萝卜素是形成鸡羽毛颜色的两类主要色素， 其中类胡萝 卜素需要从外界摄取， 而黑色素可以自身合成。 黑色素分为真黑素和褐黑素， 二者 都是酪氨 酸衍生物， 其中真黑素使羽毛 呈现黑色和深棕色， 褐黑素使羽毛 呈现红色和黄色。 研究发现 SLC45A2突变在高尔基体水平上破坏酪氨酸酶的加 工和运输， 在黑色素细胞中的表达对酪 氨酸存在一定的剂量依赖关系。 羽色色素沉着性状一直 都是国内鸡育种的一个重要选择指 标， 大量的研究发现， 鸡的各种羽色均为 一对或几对基因控制。 [0004]Sturtevant发现控制银色羽的性连锁的银色羽等位基因， 性连锁的因子只是抑制 红色色素。 银色羽对野生型为不完全显性， 银色羽的表型 受修饰基因的高度影响， 因此在一 些遗传背景下很难鉴定银色羽突变。 Wang等利用染色体 G带染色技术推断银羽基因位于Z染 色体P臂。 Gunnarsson运用连锁图谱分析定位发现了候选基因SLC45A2， 水溶载体45家族第2 成员(SLC45A2)， 之前也被称为膜相关转运蛋白(MATP)， 并且发现鸡S*AL等位基因中的 106delT突变导致了移码和提前终止密码子， 相应的mRNA被无义介导的mRNA降解， 导致携带 该等位基因个体的真黑素和褐黑素的表达几乎完全被抑制。 两个独立的错义突变 (Tyr277Cys和Leu347Met)与S*S对应， 这两个突变抑制褐黑素的表达。 Tyr277Cys突变只与 来航鸡银羽突变有关， Leu347Met 突变位于基因跨膜 域的高度保守区， 该突变和很多 银色羽 品种完全连锁。 目前尚不清楚为什么该基因座的突变导致真黑素和褐黑素几乎完全缺失， 而一些错义突变是显性的， 并导致特异性地抑制褐黑素 的产生。 分子鉴定方法不受遗传背 景的限制， 并且能够快速鉴定鸡的基因型， 对鸡的育种具有重要意 义。 [0005]初生雏鸡的雌雄鉴别分两类， 一类是根据雏鸡生殖器官的差异， 一类是利用性连 锁基因伴性交叉遗传现象。 利用性连锁基因表型差异进行自别 雌雄配套系， 鉴别速度快且 准确度高。 利用金银羽进行自别 雌雄是配套系中常用的方法， 但在其他遗传背景 的鸡群中 因金银羽位点上等位基因的表达很大程度受其他位点上修饰基因的影响， 很难准确鉴定个 体金银羽表型。 目前常用的金银羽分子鉴定方法为酶切片段电泳法， 用于大规模群体鉴定 的效率偏低。说　明　书 1/6 页 3 CN 115141891 A 3