(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610317.1 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区海大路1 号 (72)发明人 朱春华　邓秋霞　张博　黄洋　 赵娜　朱旭枫　茹笑影　王秋梅　 胡琴　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、 引 物、 试剂盒和应用 (57)摘要 本发明公开了一种高体鰤外泌体microRNAs 性别标签， 所述microRNAs性别标签为dre ‑miR‑ 223， 其碱基序列如SEQ  ID NO： 1所示。 还公开了 用于扩增所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签 的引物和试剂盒， 以及上述高体鰤外泌体 microRNAs性别标签、 引物或试剂盒在高体鰤性 别鉴定方面的应用。 本发明运用血清外泌体 microRNAs进行高体鰤雌鱼和雄鱼的判定， dre ‑ miR‑223在已经验证的样品中准确率为100％， 且 鉴定结果可靠， 不会对鱼体造成创伤； 本发明同 时利用该鉴别标签设计了针对该标签的扩增引 物， 开发了 检测的试剂盒， 方便快捷， 简单高效。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 115094148 A 2022.09.23 CN 115094148 A 1.一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签， 其特征是： 所述性别标签为dre ‑miR‑223， 其 碱基序列如SEQ  ID NO： 1所示。 2.一种用于扩增权利要求1所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签的引物， 其特征是： 所述引物为性别标签dre ‑miR‑223定量检测引物， 所述dre ‑miR‑223定量检测引物包括正向 引物dre‑miR‑223‑F和反向引物dre ‑miR‑223‑R， 其中所述正向引物dre ‑miR‑223‑F的碱基 序列如SEQ  ID NO： 2所示， 所述反向引物dre ‑miR‑223‑R的碱基序列如SEQ  ID NO： 3所示。 3.一种用于高体鰤性别鉴定的试剂盒， 其特征是： 所述试剂 盒包括权利要求2中的dre ‑ miR‑223定量检测引物、 dre ‑miR‑223逆转录引物dre ‑miR‑223‑RT、 内参基因oni ‑let‑7a定 量检测引物、 o ni‑let‑7a逆转录引物o ni‑let‑7a‑RT以及RT ‑PCR和qPCR常规试剂。 4.根据权利要求3所述的用于高体鰤性别鉴定试剂 盒， 其特征是： 所述逆转录引物dre ‑ miR‑223‑RT的碱基序列如SEQ  ID NO： 4所示； 所述内参基因oni ‑let‑7a定量检测引物包括 正向引物oni ‑let‑7a‑F和反向引物oni ‑let‑7a‑R， 其中所述正向引物oni ‑let‑7a‑F的碱基 序列如SEQ  ID NO： 5所示， 所述反向引物oni ‑let‑7a‑R的碱基序列如SEQ  ID NO： 6所示； 所 述oni‑let‑7a逆转录引物o ni‑let‑7a‑RT的碱基序列如SEQ  ID NO： 7所示。 5.权利要求1所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签在高体鰤性别鉴定方面的应用。 6.权利要求2所述引物或权利要求3 ‑4任一项所述试剂盒在高体鰤性别鉴定方面的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094148 A 2一种高体鰤外泌体microRNA s性别标签 、 引物、 试剂盒和应用 技术领域 [0001]本发明属于水产养殖技术领域， 具体涉及一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、 引物、 试剂盒和应用。 背景技术 [0002]高体鰤(Seriola  dumerili)是一种生长速度快， 肉质好， 营养价值高的世界性深 远海经济 鱼类。 高体鰤是雌雄异体鱼类， 其无表型性别二态 性， 因此难以从鱼体表面直接鉴 定鱼的性别。 而且在人工养殖条件下， 高体鰤表现出严重的生殖功能障碍， 性别鉴定困难这 一问题也极大地阻碍 了高体鰤的工厂化养殖。 [0003]鱼类性别鉴定有生理解剖观察、 性腺切片、 性腺细胞观察、 雌性特异分子标记等多 种方法。 外泌体内含物microRNAs， 其在进化上高度保守， 性质稳定， 易于定量检测， 具有生 物标签的条件， 对于鱼类性别鉴定的具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种指示性别的高体鰤外泌体microRNAs性别标签、 用于 扩增所述高体鰤外泌体microRNAs性别 标签的引物和试剂盒， 以解决难以从鱼体表面直接 鉴定高体鰤雌鱼和雄鱼的难题。 [0005]本发明的目的还在于提供上述高体鰤外泌体microRNAs性别标签、 引物或试剂盒 在高体鰤性别鉴定方面的应用。 [0006]本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现： 一种高体鰤外泌体 microRNAs性别标签， 所述microRNAs性别标签为dre ‑miR‑223， 其碱基序列如SEQ  ID NO： 1 所述。 [0007]本发明针对高体鰤雌鱼和雄鱼识别问题， 提出一种高体鰤血清来源的外泌体 microRNAs作为 生物标记 物， 用于识别雌鱼和雄鱼。 [0008]将高体鰤血清外泌体microRNA性别标签在高体鰤性别鉴定中的应用时， microRNA 性别标签为dre ‑miR‑223， 其序列为TGTCAGT TTGTCAAATACCCC。 [0009]所述miRNAs性别标签具有在雌鱼和雄鱼中显著差异表达的特点， 是特异的分子识 别标记。 [0010]本发明中的高体鰤外泌体microRNAs性别标签， 优选通过以下 方法筛选获得： [0011]1)血清外泌体分离鉴定后， 对3尾雌鱼和3尾雄鱼血清外泌体small  RNA进行测序 分析， 将raw  reads进行过滤， 得到clean  reads， 将clean  reads依次与Rfam数据库、 cDNA序 列、 物种重复序列库和miRBase数据库进行比对注释； 统计已知microRNA并预测新的 microRNA； 对microRNA进行差异表达分析， 对差异表达miRNA的靶基因进行Gene  Ontology (GO)富集分析和Kyoto  Encyclop edia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析， 最后与雌 鱼和雄鱼样品进行相关性匹配， 筛选出一种或者多种， 对两种样品具有指示作用的 microRNA作为 候选microRNAs生物标记 物。说　明　书 1/7 页 3 CN 115094148 A 3