(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210636586.5 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 公安部物证鉴定中心 地址 100038 北京市西城区木樨地 南里17 号 申请人 华中农业大 学 (72)发明人 胡胜　汪方奎　王乐　胡哲　 艾克拜尔·热合曼　杨月华　 肖玉杰　 (74)专利代理 机构 武汉华之喻知识产权代理有 限公司 42 267 专利代理师 王珣珏　张彩锦 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的 方法 (57)摘要 本发明属于DNA提取技术领域， 具体公开了 一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法， 包括： 利用细胞预处理试剂 对细胞培养物进行预 处理， 并收集细胞； 利用细胞轻柔裂解液对预处 理后的细胞进行裂解； 将裂解后的溶液进行离 心， 分离上清液， 纯化得到细胞线粒体基因组； 细 胞轻柔裂解液包括0.1％～15％NP ‑40、 0.001～ 0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、 0.001～ 0.2mol/L乙二胺四乙酸、 0.1～1mol/L醋酸钠、 0.1～0.5mol/L醋酸钾和0.001～0.1mol/L柠檬 酸钠。 本发 明方法可以从少量培养细胞中高效获 得高纯度线粒体基因组DNA， 耗时短， 设备要求 低， 操作简单， 重复性 好。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 115161313 A 2022.10.11 CN 115161313 A 1.一种高效高纯度分离细胞线粒体 基因组的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 利用细胞预处理试剂对细胞培养物进行预处理以去除细胞外杂质DNA， 并收集细 胞； S2、 利用细胞 轻柔裂解液对预处 理后的细胞进行裂解； S3、 将裂解后的溶 液进行离心， 分离上清液， 纯化得到细胞线粒体 基因组； 其中， 所述细胞轻柔裂解液包括0.1％～15％(v/v)NP ‑40、 0.001mol/L～0.1mol/L三 (羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、 0.001mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸、 0.1mol/L～1mol/L醋酸 钠、 0.1mo l/L～0.5mo l/L醋酸钾 和0.001mol/L～0.1mo l/L柠檬酸钠。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤S1中， 所述细胞预处理试剂包括 0.001mol/L～0.01mol/L乙二胺四乙酸和0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸 盐。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在 于， 步骤S1具体为： 将含有1 ×102～1×105个细 胞的细胞培养物进行1000rpm～2000rpm离心5min～10min， 弃上清； 接着用生理盐水或PBS 缓冲液进行悬浮漂洗， 再次以1000rpm～2000rpm离心5min～10min， 弃上清； 然后用所述细 胞预处理试剂进行悬浮漂洗， 静置5min～10min， 以1000rpm～2 000rpm离心 5min～10min， 弃 上清， 沉淀即为预处 理后的细胞。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S2具体为： 向所述预处理后的细胞中 加入100 μL～500 μL所述细胞轻柔裂解液， 轻柔吹散后， 放入冰上处理15min～30min， 其间每 隔5min颠倒混匀一次。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S3中包括两次离心过程， 具体为： 将所 述裂解后的溶液在4℃条件下进行3000rpm～3500rpm离心5min～15min， 收集第一次上清 液； 再向沉淀中加入100μL～400μLPBS缓冲液， 吹打、 悬浮沉淀， 然后再次以3000rpm～ 3500rpm离心5min～15min， 收集第二次上清液， 将所述第一次上清液和所述第二次上清液 混合。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 所述纯化过程具体为： 向分离的 上清液中加入等体积线粒体基因组纯化试剂， 蜗旋振荡1min～5min， 于45℃～60℃水浴处 理3min～10min； 然后加入一倍体积异丙醇， 混匀后置于 ‑20℃静置5min～20min， 以 10000rpm～15000rpm离心10min～20min； 去除上清， 所得沉淀即为纯化的线粒体基因组 DNA。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述线粒体基因组纯化试剂包括 0.001mol/L～0.01mol/L乙二胺四乙酸、 0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸 盐、 0.02mo l/L醋酸钠、 0.5％～5％(v/v)十二 烷基磺酸钠和1 μg/ μL～5 μg/ μL蛋白酶K。 8.根据权利要求1 ‑7任一所述的方法， 其特征在于： 还包括步骤S4， 以分离的细胞线粒 体基因组为模板， 分别利用线 粒体基因组特异 性引物和细胞核基因组特异 性引物为引物进 行PCR反应， 验证分离的细胞线粒体 基因组的纯度。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述线粒体 基因组特异性引物为： mitoF:AACATACCCATGGCCAACCT； mitoR:AGCGA AGGGTTGTAGTAGC CC。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述细胞核基因 组特异性引物为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115161313 A 2nF:GAGTTTCCTGGACAAATGAG； nR:CATTGTTTCATATCTCTG GCG。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115161313 A 3