(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210704969.1 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 杨立桃　朱早兵　郭永坤　张大兵　 (74)专利代理 机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 3123 6 专利代理师 胡晶 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导 的核酸分子 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种一锅法单链DNA环化扩增 和CRISPR/Cas介导的核酸 分子检测方法， 本发明 包括： 单链DNA 探针环化、 滚环扩增、 单链DNA的双 探针CRISPR/Cas剪切识别及其单管一锅法检测 反应。 本发明主要针对环化、 扩增、 剪切识别不能 同步进行的难题， 采用一种同时衔接环化、 扩增 和剪切识别三步 反应的OPERATOR技术， 在体外 单 一反应管体系中对核酸分子精确、 灵敏、 快速检 测。 本发明相比传统的核酸分子检测方法， 具有 如下优点： 适用于 单链DNA、 双 链DNA和RNA分子的 灵敏快速检测。 特别是， 检测RNA时不需要逆转 录； 直接进行一锅法检测， 不需要分步反应， 在核 酸分子检测领域具有广泛的应用前 景。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图3页 CN 114958978 A 2022.08.30 CN 114958978 A 1.一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法， 其特征在于， 所述 核酸分子检测方法包括如下步骤： (1)从检测样本中提取核酸样本； (2)配制反应系统混合液， 所述混合液包括： 单链DNA探针、 双荧光标记单链DNA探针、 寡 核苷酸引物、 DNA连接酶或其变体、 链置换DNA聚合 酶或其变体、 向导RNA或其衍生物、 CRISPR 相关Cas蛋白或其变体、 OPERATOR反应缓冲液； 其中， 所述向导RNA或其衍生物包含与待检测 核酸分子的靶序列相同的序列， 单链DNA探针与待检测核酸分子的一条链特异 性的互补， 且 单链DNA的骨架序列指除互补 靶标部分的序列或其衍生物以外， 还包括PAM位点序列和随机 连接序列； (3)将核酸样本加入反应 体系混合液中， 进行恒温反应； (4)荧光探针被剪切后产生可以检测的荧光信号， 读取和记录产生的荧光信号， 得核酸 检测结果。 2.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述核酸样本中 待检测核酸分子包括单链DNA、 双链DNA、 单链RNA中的一种或多种。 3.根据权利 要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述单链DNA探针 的5’端和3’端分别和待检核酸分子序列互补， 其中所述单链DNA的骨架序列指除互补靶标 部分的序列或其 衍生物以外， 还 包括PAM位 点序列和随机连接序列。 4.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述寡核苷酸引 物为碱基修饰后的随机引物或与待检测核酸分子序列一 致的引物。 5.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 所双荧光标记单链DNA探针 的序列和待检核酸分子序列互补， 探针的5 ’端、 3’端标记有荧光基团； 探针的5 ’端的荧光基 团包括FAM、 HEX、 VIC、 Cy5、 Cy3、 ROX、 FITC、 Joe中的一种， 3 ’端标记的荧光淬灭基团包括 TAMRA、 BHQ1、 MGB、 BHQ2中的一种。 6.根据权利 要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述DNA连接酶为 连接双链DNA分子或者RNA/DNA杂交双链的单链DNA缺口的连接酶； DNA连接酶包括T4  DNA连 接酶、 E.coli  DNA连接酶、 SplintR连接酶、 HiFi  Taq DNA ligase中的一种； 所述链 置换DNA 聚合酶包括Phi2 9、 Klenow、 Vent中的一种。 7.根据权利要求1所述的OPERATOR等温检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述CRISPR 相关Cas蛋白为具有双链DNA或单链DNA识别剪切功能和反式DNA单链剪切功能的CRISPR ‑ Cas核酸酶； 所述CRISPR ‑Cas核酸酶包括SpyCas9、 FnCas9、 FnCas12a， LbCas12、 BhCas12b、 Bs3Cas12b、 LsCas12b、 SbCas12b、 AaCas12b、 AkCas12、 AmCas12b、 BsCas12b、 DiCas12b、 TcCas12b、 Aac Cas12b、 L wCas13、 Cas14中的一种或其变 体中的一种。 8.根据权利 要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述向导RNA或其 衍生物的间隔序列 与目标核酸分子序列互补。 9.根据权利要求1所述的核酸分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述OPERATOR反 应缓冲液包括1 ‑5mM dNTP、 10‑100mM Tris‑HCl、 5‑25mM MgCl2、 0.01‑20mM ATP、 0.5‑10mM  DTT和0.5‑1.5mg/ml牛 血清蛋白， 所述缓冲液pH值在6.5 ‑8.0之间。 10.一种基于权利要求1所述的核酸分子检测方法的等温核酸检测试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒包括酶混合液、 单链DNA探针、 向导RNA、 双荧光标记单链DNA探针、 寡核苷酸权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958978 A 2引物和OPERATOR反应缓冲液； 所述酶混合液包括CRISPR ‑Cas核酸酶、 DNA连接酶、 链置换DNA 聚合酶。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958978 A 3