(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210723623.6 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 洛阳吉恩特生物科技有限公司 地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路 21号卓阳 科技园1号楼1010室 (72)发明人 李猛　宁静　王震光　 (74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 徐云侠 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/42(2006.01)C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引 物探针组、 方法及应用 (57)摘要 本发明涉及同时检测四种致病菌的多重荧 光定量PCR引物探针组、 方法及应用， 属于分子生 物学领域， 所述探针引物组包含分别针对金黄色 葡萄球菌Nuc基因、 沙门氏菌invA基因、 单核增生 李斯特菌Hly基因和大肠杆菌O157:H7rfbE基因 的引物对与探针。 本发明结合实时荧光定量PCR 以及多重荧光定量PCR技术， 提供的可以同时检 测金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 单核增生李斯特 菌、 大肠杆菌O15 7:H7四种致病菌的方法， 极大地 提升检测 效率， 节约检测成本， 满足大规模快速 检测的需要。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 115029458 A 2022.09.09 CN 115029458 A 1.同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组， 其特征在于： 所述探针引物 组 包含分别针对金黄色葡萄球菌Nuc基因、 沙门氏菌invA基因、 单核增生李斯特菌Hly基因和 大肠杆菌O157:H7rfbE基因的引物对与探针； 其中， 针对金黄色葡萄球菌Nuc基因的上游引物为序列如SEQ  ID NO： 1所示的Nuc ‑F， 下 游引物为序列如SEQ  ID NO： 2所示的Nuc ‑R， 探针为序列如SEQ  ID NO： 3所示的Nuc ‑P； 针对 沙门氏菌invA 基因的上游引物为序列如SEQ  ID NO： 4所示的invA ‑F， 下游引物为序列如SEQ   ID NO： 5所示的i nvA‑R， 探针为序列如SEQ  ID NO： 6所示的i nvA‑P； 针对单核增生李斯特菌Hly基因的上游引物为序列如SEQ  ID NO： 7所示 的Hly‑F， 下游 引物为序列如SEQ  ID NO： 8所示的Hly ‑R， 探针为序列如SEQ  ID NO： 9所示的Hly ‑P； 针对大肠杆菌O157:H7rfbE基因的上游引物为序列如SEQ  ID NO： 10所示的rfbE ‑F， 下 游引物为序列如SEQ  ID NO： 11所示的rfbE ‑R， 探针为序列如SEQ  ID NO： 12所示的rfbE ‑P。 2.根据权利要求1所述的引物探针组， 其特征在于： 所述金黄色葡萄球菌Nuc基因的探 针序列5’端修饰有TexRed， 所述沙门氏菌invA 基因的探针序列5 ’端修饰有Cy5， 所述单核增 生李斯特菌Hly基因的探针序列5 ’端修饰有HEX， 所述大肠杆菌O157:H7rfbE基因的探针序 列5’端修饰有FAM； 所有探针的3 ’端均修饰有BHQ1。 3.一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR方法， 其特征在于： 包括以下步 骤： 步骤一、 提取待测样本的基因 组DNA备用； 步骤二、 将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中， 所述 体系包含权利要求2所述的引物探针组； 步骤三、 将步骤二所述反应体系放置于荧光定量PCR仪中进行扩增， 收集PCR扩增过程 中的荧光信号， 通过荧 光信号分析判断是否存在致病菌 。 4.一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒 包括PCR反应液， 所述反应液中含有权利要求2所述的引物探针组。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 所述反应液包含反应液A和反应液B； 所 述反应液A为2 ×PCR Mix， 包含的组分为： Taq酶4 ‑8U、 dNTP 500nM、 pH8.3的Tris ‑HCL  200mM、 KCL  800mM和Mg2+10mM； 所述反应液B的组分为： 四种致病菌的引物Nuc ‑F、 Nuc‑R、 invA‑F、 invA‑R、 Hly‑F、 Hly‑R、 rfbE‑F、 rfbE‑R各500nM与探针Nuc ‑P、 invA‑P、 Hly‑P、 rfbE‑P 各400nM。 6.根据权利要求5所述的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还包括阴性质控 品和阳性质 控品； 所述阴性质控品为DEPC水， 所述阳性质控品为根据金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 单核 增生李斯特菌、 大肠杆菌O157:H7目的基因构建的质粒按照1:1:1:1比例的混合物。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于： 采用所述试剂 盒进行致病菌检测的方法 为： 反应液A10ul， 反应液B1.8ul， 加入50 ‑100ng模板， 补水至20ul组成反应体系， 按照95℃ 5min‑10min， 95℃变性2 0s‑30s， 60℃退火/延伸30s ‑35s， 40个循环程序进行荧光定量PCR反 应； 收集PCR扩增过程中的荧光信号， 通过待测样本中某一通道基因的Ct值及S型扩增曲线 进行阳性判断。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于： 判断标准为： a).若待测样本某基因通道 扩增有S型扩增曲线， 且Ct≦35， 则判断待测样 本含有致病菌； b).若待测样本某基因通道没权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029458 A 2有S型扩增曲线， 且Ct≧35， 则判断待测样本不含有致病菌； c).若待测样本某基因通道有S 型扩增曲线， 且3 5≦Ct<40， 则判断为 不确定样本， 重新 提取核酸复检。 9.权利要求2所述的引物探针组、 权利要求3所述的检测方法或权利要求4 ‑8任意一种 所述的试剂盒在以下任意 一种中的应用： (a)检测金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7中至少一 种致病菌； (b)制备用于(a)检测的药物或产品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029458 A 3