(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210638211.2 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 广东省科 学院微生物研究所 （广东 省微生物分析检测中心） 地址 510075 广东省广州市越秀区先烈中 路100号大院6 6号楼 申请人 广东环凯生物科技有限公司 (72)发明人 叶青华　李兵　吴清平　张菊梅　 代京莎　陈玲　陈谋通　薛亮　 丁郁　王涓　吴诗　古其会　庞锐　 韦献虎　张友雄　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 郝传鑫　周全英(51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特 异性新分子靶标及其快速 检测方法 (57)摘要 本发明公开了唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰 毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方 法， 属于分子生物学与微生物检验技术领域。 本 发明的核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别 唐菖蒲伯 克霍尔德菌及其椰毒致病变种中的应 用， 所述核苷酸序列组合如SEQ  ID NO.1～SEQ   ID NO.3所示。 本发明无需经过生理生化鉴别即 可检测到唐菖蒲伯克霍尔德菌， 可弥补生化试验 不能鉴定高毒型唐菖蒲伯 克霍尔德菌椰毒致病 变种的缺陷， 检测时间短、 成本低、 操作简单、 特 异性强； 本发 明可弥补现有分子检测与分子分型 唐菖蒲伯 克霍尔德菌特异性差和缺乏高毒型唐 菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种方法的缺陷， 检 测结果更准确， 结果判定更简单， 实用性更强。 权利要求书2页 说明书17页 序列表3页 附图4页 CN 115198026 A 2022.10.18 CN 115198026 A 1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种中 的应用， 其特征在于， 所述核苷酸序列组合如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.3所示； 所述应用为 非疾病诊断和治疗目的 的应用。 2.根据权利 要求1所述的应用， 其特征在于， 所述序列SEQ  ID NO.1～2用于鉴别唐菖蒲 伯克霍尔德菌； 所述序列SEQ  ID NO.3用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。 3.用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的引物组， 其特征在于， 所述引物 组为根据权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到 。 4.根据权利要求3所述的引物组， 其特征在于， 所述引物组的序列按5 ’到3’如SEQ ID  NO.4～9所示； 其中： SEQ ID NO.4和SEQ  ID NO.5为对应SEQ  ID NO.1序列的引物组； SEQ ID NO.6和SEQ  ID NO.7为对应SEQ  ID NO.2序列的引物组； SEQ ID NO.8和SEQ  ID NO.9为对应SEQ  ID NO.3序列的引物组。 5.一种鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求3或4所述的引物组。 6.一种非疾病 诊断和治疗目的的鉴别 唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法， 其特征在于， 所述方法包括PCR方法和定量qPCR方法。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR方法包括以下步骤： S1： 使用如权利要求3或4所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增； S2： 进行凝胶电泳检测扩增产物； S3： 观察引物 组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带， 如果存在， 说 明待测样品中含有对应的目标菌； 如果没有出现相应的单一扩增条带， 则待测样品中不含 有对应的目标菌； 所述目标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变 种； 所述S1中的PCR扩增体系包 括PCR反应缓冲液、 模板DNA、 PCR聚合酶、 dNTP、 MgCl2、 引物组 和灭菌双蒸水。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增体系为： 10 ×PCR反应缓冲液 2.5 μL， 25 mM MgCl2 2.0 μL， 2.5 mM dNTP 1.0 μL， 模板DNA  1～2 μL， 5 μM上下游引物各1 μL， Taq 酶1U， 灭菌双蒸水补足体积至25 μL； 所述S1 中的PCR扩增程序为： 95℃预变性5min； 95℃变性 30s； 60～64℃退火30s； 72℃延伸30s； 变性、 退火、 延伸共进行30 ‑35个循环； 最后72℃延伸 10min。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述qPCR方法包括以下步骤： S1： 使用如权利要求3或4所述引物组中的其中一种对待测样品DNA在荧光定量扩增仪 上进行PCR扩增； S2： 利用相应的荧光定量软件分析扩增结果是否符合预期， 如果产生荧光信号， 说明待 测样品中含有目标菌； 如果不产生荧光信号， 说明待测样品中不含有对应的目标菌； 所述目 标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种； 所述S1中的qPCR扩增体系包括2 ×TB Green Premix、 模板DNA、 引物组和灭菌双蒸水。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述qPCR扩增体系为： 2 ×TB Green  Premix反应液 10 μL， 模板DNA100ng， 10 μmol/L上下游引物各 1 μL， 灭菌双蒸水补足体积至20 μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115198026 A 2L； 所述S1中的qPCR扩增程序为： 95℃预变性10min； 9 5℃变性5s， 62℃退火60s， 变性、 退火共 进行45个 循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115198026 A 3