(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210683437.4 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 吉林大学 地址 130062 吉林省长 春市西安大路5 333 号 (72)发明人 李占军　隋婷婷　李金泽　张涛　 赵飞宇　范鹏　孙小迪　 (74)专利代理 机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 2 2100 专利代理师 白冬冬 (51)Int.Cl. C12N 15/89(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/13(2006.01)A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法 (57)摘要 一种基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方 法， 属于生物技术领域。 本发明的目的是为开发 兔单克隆抗体， 采用CRISPR技术创建一种可以制 备高产抗体兔的方法。 本发明步骤是： 获得足够 数量兔受精卵， 胚胎显微注射， 兔基因型鉴定。 本 发明为开发兔单克隆抗体提供一种手段， 促进抗 体制备技术将在诊断、 药效学及临床应用中发挥 前所未有的重大作用， 引领新型治疗性抗体研究 的崭新时代。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114891834 A 2022.08.12 CN 114891834 A 1.一种基于 CRISPR技术制备高产抗体兔的方法， 其特 征在于： 其 步骤是： 步骤1、 获得足够数量兔受精卵： 选用雌性新西兰大白兔， 在发情期内经肌肉注射促卵 泡激素50  IU， 以促进卵泡 发育成熟， 每12小时注 射一次， 连续注 射3天， 最后一次注 射后， 与 公兔进行交配， 将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100  IU人绒毛膜促性腺激素， 在 注射18‑20h后， 取出卵巢和输卵管放于培养皿中， 使用冲卵液DPBS ‑BSA冲出受精胚胎， 将胚 胎移入培 养液EBSS中， 置于38.5℃， 5%  CO2饱和湿度的培 养箱内孵 育待用； 步骤2、 胚胎显微注射： 将体外合成的50ng/UL  的IGHG‑sgRNA、 单链DNA和200ng/UL的   Cas9mRNA， 离心后混合， 吸出3 μL至注射针中， 进行胚胎细胞核注射， 注射后的30 ‑50枚受精 卵移植到同期发情的受体母兔输卵管中， 对代孕母兔提供充足的饲料和饮水， 保持干净饲 养环境， 规范化饲养， 妊娠至20天后， 转至产房饲养 至预产期； 步骤3、 兔基因型鉴定： 提取组织的DNA， 进行PCR及测序， 确定基因型； PCR 引物： 上游引物： SEQ  ID NO. 4： GACCACCATCACCATCTTCA 下游引物： SEQ  ID NO. 3： GGGTGGACGACAGATGC PCR反应体系 模板 1ul 上游引物  1ul 下游引物  1ul 2X taqplus 12.5 ul 二馏水 9.5ul 反应的条件： 95℃预变性5min； 95℃ 变性30s， 58℃退火30s， 72℃延伸30s； 35个循环； 72 ℃ 延伸5min； PCR产物进行测序， 若在sgRNA序列的第19位的G突变成A， 则证明获得单碱基 突变。 2.根据权利 要求1所述的基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法， 其特征在于： 单链设 计是依据sgRNA序列， 在IGHG基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上50bp， 并对sgRNA上的 第19位的G突变成A， 特异性的寡聚核苷酸单链序列为SEQ  ID NO. 2。 3.根据权利 要求2所述的基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法， 其特征在于： 针对兔 IGHG序列， 设计针对其尾部酪氨酸基序进行突变的sgRNA， 特异性sgRNA序列为SEQ  ID NO.  1。 4.根据权利要求2或3所述的基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法， 其特征在于： sgRNA合成方法： 采用固相亚磷酰胺 三酯法， 以商业化DNA 合成仪为主要合 成平台进 行生产， 将单个核苷酸进行连接， 形成短链DNA， 合成时从3 ’ ‑5’方向进行， 相邻的核苷酸通过3 ’ ‑5’ 磷酸二酯键连接， 通常3 ’端第一个碱基结合在CPG上； 步骤： 经过脱保护， 活化缩合， 盖帽和 氧化四个步骤完成一个碱基的添加； 上游： 5 ’ ‑CTACAGGAACATGATCG GGC‑3’ 下游5’ ‑GCCCGATCATGT TCCTGTAG‑3’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891834 A 2基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]由于小鼠免疫系统不能识别某些免疫原， 尤其是鼠源性的免疫原， 而兔能对外源 蛋白质产生强烈的免疫反应， 并具有高的亲和 性， 在众多免疫学实验中兔多克隆抗体得到 广泛应用。 近年来， CRISPR/Cas9基因编辑技术已为高效率基因编辑开辟了一条全新的思 路， 极大的推动了基因修饰动物的发展， 并成功应用于斑马鱼、 小鼠、 大鼠、 兔、 猪、 猴子等多 个物种。 发明内容 [0003]本发明的目的是为开发兔单克隆抗体， 采用C RISPR技术创建一种可以制备高产抗 体兔的方法。 [0004]本发明步骤是： 步骤1、 获得足够数量兔受精卵： 选用雌性新西兰大白兔， 在发情期内经肌肉注射 促卵泡激素50  IU， 以促进卵泡发育成熟， 每12小时注射一次， 连续注射3天， 最后一次注射 后， 与公兔进行交配， 将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100  IU人绒毛膜促性腺激 素， 在注射18 ‑20h后， 取出卵巢和输卵管放于培养皿中， 使用冲卵液DPBS ‑BSA冲出受精胚 胎， 将胚胎移入培 养液EBSS中， 置于38.5℃， 5%  CO2饱和湿度的培 养箱内孵 育待用； 步骤2、 胚胎显微注射： 将 体外合成的50ng/UL  的IGHG‑sgRNA、 单链DNA和200ng/UL 的 Cas9mRNA， 离心后混合， 吸出3 μL至注射针中， 进行胚胎细胞核注射， 注射后的30 ‑50枚受 精卵移植到同期发情的受体母兔输卵管中， 对代孕母兔提供充足的饲料和饮水， 保持干净 饲养环境， 规范化饲养， 妊娠至20天后， 转至产房饲养 至预产期； 步骤3、 兔基因型鉴定： 提取组织的DNA， 进行PCR及测序， 确定基因型； PCR 引物： 上游引物： SEQ  ID NO. 4： GACCACCATCACCATCTTCA 下游引物： SEQ  ID NO. 3： GGGTGGACGACAGATGC PCR反应体系 模板 1ul 上游引物  1ul 下游引物  1ul 2X taqplus 12.5 ul 二馏水 9.5ul 反应的条件： 95℃预变性5min； 95℃变性30s， 58℃退火30s， 72℃延伸30s； 35个循 环； 72℃ 延伸5min； PCR产物进行测序， 若在sgRNA序列的第19位的G突变成A， 则证明获得单 碱基突变。 [0005]本发明单链设计是依据s gRNA序列， 在IGHG基因序列上s gRNA序列的左右选择各加说　明　书 1/6 页 3 CN 114891834 A 3