(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210767438.7 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所 (中国动物卫 生与流行病学中心哈 尔滨分中心) 地址 150069 黑龙江省哈尔滨市香坊区哈 平路678号 (72)发明人 赵东明　步志高　孙恩成　李芳　 朱远茂　丁蕾蕾　 (74)专利代理 机构 北京爱棱台知识产权代理事 务所(普通 合伙) 16054 专利代理师 张洪生　武志宏 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基因I型与II型非洲猪瘟病毒鉴别检测引物 及其应用 (57)摘要 本发明公开了基因I型与II型非洲猪瘟病毒 鉴别检测引物及其应用， 具体为一种核酸组合， 包括序列如SEQ  ID NO.3所示的第一引物， 序列 如SEQ ID NO.4所示 的第二引物， 序列如SEQ  ID  NO.5所示的第三引物， 序列如SEQ  ID NO.6所示、 5’端连接有Cy5、 3 ’端连接有BHQ2的第一探针， 以 及序列如SEQ  ID NO.7所示、 5 ’端连接有FAM、 3 ’ 端连接有TAMRA 的第二探针。 本发明还公开了包 含前述核酸组合的试剂盒， 以及前述核酸组合或 前述试剂盒在制备鉴别检测基因I型与II型非洲 猪瘟病毒的制剂或系统中的应用。 该核酸组合敏 感性好， 特异性高， 能够通过qPCR对基因I型与II 型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图4页 CN 115369186 A 2022.11.22 CN 115369186 A 1.一种核酸组合， 所述核酸组合 为第一核酸组合或第二核酸组合； 所述第一核酸组合包括第一引物， 第二引物， 第三引物， 第一探针和第二探针； 所述第二核酸组合包括第四引物， 第五引物， 第六引物， 第三探针和第四探针； 其中： 所述第一引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述第二引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述第三引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述第一探针中， 核酸序列或其互补序列如SEQ  ID NO.6所示， 一端连接有第一荧光基 团， 另一端连接有第一淬灭基团； 所述第二探针中， 核酸序列或其互补序列如SEQ  ID NO.7所示， 一端连接有第二荧光基 团， 另一端连接有第二淬灭基团； 所述第一淬灭基团能够淬灭所述第一 荧光基团发出的荧 光； 所述第二淬灭基团能够淬灭所述第二 荧光基团发出的荧 光； 所述第一 荧光基团不能够淬灭所述第二 荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧 光； 所述第一淬灭基团不能够淬灭所述第二 荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧 光； 所述第二 荧光基团不能够淬灭所述第一 荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧 光； 所述第二淬灭基团不能够淬灭所述第一 荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧 光； 所述第四引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述第五引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 所述第六引物下游的特异性核酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 所述第三探针中， 核酸序列或其互补序列如SEQ  ID NO.6所示， 一端连接有第三荧光基 团， 另一端连接有第三淬灭基团； 所述第四探针中， 核酸序列或其互补序列如SEQ  ID NO.7所示， 一端连接有第四荧光基 团， 另一端连接有第四淬灭基团； 所述第三淬灭基团能够淬灭所述第三 荧光基团发出的荧 光； 所述第四淬灭基团能够淬灭所述第四荧 光基团发出的荧 光； 所述第三 荧光基团不能够淬灭所述第四荧 光基团或所述第四淬灭基团发出的荧 光； 所述第三淬灭基团不能够淬灭所述第四荧 光基团或所述第四淬灭基团发出的荧 光； 所述第四荧 光基团不能够淬灭所述第三 荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧 光； 所述第四淬灭基团不能够淬灭所述第三 荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧 光。 2.如权利要求1所述的核酸组合， 其特征在于， 所述第一探针中， 5 ’端连接有第一荧光 基团， 3’端连接有第一淬灭基团； 所述第二探针中， 5 ’端连接有第二 荧光基团， 3 ’端连接有第二淬灭基团； 优选地， 所述第一荧光基团为Cy5， 所述第一淬灭基团为BHQ2， 所述第二荧光基团为 FAM， 所述第二淬灭基团为TAMRA； 或者 所述第一荧光基团为FAM， 所述第一淬灭基团为TAMRA， 所述第二荧光基团为Cy5， 所述 第二淬灭基团为BHQ2。 3.如权利要求1所述的核酸组合， 其特征在于， 所述第三探针中， 5 ’端连接有第三荧光 基团， 3’端连接有第三淬灭基团；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115369186 A 2所述第四探针中， 5 ’端连接有第四荧 光基团， 3 ’端连接有第四淬灭基团； 优选地， 所述第三荧光基团为Cy5， 所述第三淬灭基团为BHQ2， 所述第四荧光基团为 FAM， 所述第四淬灭基团为TAMRA； 或者 所述第三荧光基团为FAM， 所述第三淬灭基团为TAMRA， 所述第四荧光基团为Cy5， 所述 第四淬灭基团为BHQ2。 4.如权利要求1所述的核酸组合， 其特征在于， 所述第一引物的核酸序列如SEQ  ID  NO.3所示； 所述第二引物的核酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述第三引物的核酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 5.如权利要求1所述的核酸组合， 其特征在于， 所述第四引物的核酸序列如SEQ  ID  NO.3所示； 所述第五引物的核酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 所述第六引物的核酸序列如SEQ  ID NO.10所示。 6.一种试剂盒， 所述试剂盒中含有权利要求1 ‑5中任一项所述的核酸组合。 7.一种非诊断目的的鉴别检测基因I型非洲猪瘟病毒与基因II型非洲猪瘟病毒的方 法， 所述方法为： 使用权利要求 1‑5中任一项 所述的核酸组合对从目标检测样本所提取出来 的核酸进行qPCR检测。 8.如权利要求7 所述的方法， 所述方法包括如下步骤： S1： 提取目标检测样本的基因 组模板； S2： 将所述基因组模板、 所述第一核酸组合或第二核酸组合、 qPCR反应试剂混合， 得到 反应体系； S3： 对所述反应体系进行热循环， 通过荧光信号针对I型非洲 猪瘟病毒与基因II型非洲 猪瘟病毒 进行鉴别检测。 9.如权利要求8所述的方法， 所述热循环中， 预处理为： 95℃， 30s， 温度循环程序为： 95 ℃， 10s， 6 0℃， 30s， 循环次数为38 ‑42。 10.权利要求1 ‑5中任一项所述的核酸组合或权利要求6所述的试剂 盒在制备鉴别检测 基因I型非洲猪瘟病毒与基因I I型非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115369186 A 3