(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210896919.8 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 昆山迪安医学检验实验室有限公司 地址 215300 江苏省苏州市昆山市花 桥镇 金洋路15号金融园15号楼 (72)发明人 周明先　田明民　 (74)专利代理 机构 北京远智汇知识产权代理有 限公司 1 1659 专利代理师 康亚健 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 实时检测丙型肝炎病毒核酸的荧光定量PCR 检测方法及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 公开了一种实时 检测丙型肝炎病毒核酸的荧光定量PCR检测方法 及其试剂盒， 该检测方法如下： 核酸的提取； 荧光 定量RT‑PCR的检测。 本发明提供的一种实时检测 丙型肝炎病毒核 酸的荧光定量PCR检测方法及其 试剂盒， 能够实现完全快速检测出HCV所有已知6 个基因型， 且灵敏度高， 缩短检测 “窗口期”， 满足 对于病毒感染 “早发现， 早诊断， 早治疗 ”的需要， 适用于人血清、 血浆中的丙型肝炎病毒核酸的定 量检测， 辅助诊断是否感染丙型肝炎病毒， 适用 于临床及现场检测。 权利要求书2页 说明书10页 CN 115287374 A 2022.11.04 CN 115287374 A 1.一种实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在于， 所述检测方 法的步骤如下： 步骤1： 核酸的提取： 将血清样本于0.1 ‑1％的DEPC处理超纯水室温下搅拌， 加入裂解液于室温裂解后， 加入 洗脱液I， 振荡并离心后取上清液， 在所述上清液中加入新型生物纳米磁珠于室温下吸 附， 去除上清液， 加入洗脱 液II混匀， 静置去除上清液， 加入洗脱液III于 室温下洗脱即得到RNA 溶液； 其中， 所述新型生物纳米 磁珠由Fe3O4@SiO2纳米磁珠和改性硅烷偶联剂制得； 所述裂解液由Tris ‑HCl、 异硫氰酸胍、 尿素按照质量比3 ‑4:400‑500:0.05 ‑1的比例混 合制得； 所述洗脱液I由氯仿异戊醇、 Tris ‑HCl按照质量比15 ‑30:1‑2的比例混合制得； 所述洗脱液I I由盐酸胍、 异丙醇按照质量比1:1 ‑3的比例混合制得； 所述洗脱液III由无水乙醇、 0.1 ‑1％的DEPC处理超纯水按照质量比1:2 ‑3的比例混合 制得； 步骤2： 荧 光定量RT ‑PCR的检测： 将RT‑qPCR反应液、 RT ‑PCR酶混合物按照体积比15 ‑25:1的比例混合， 振荡均匀后得到 混合液， 将所述混合液和步骤1提取得到的RNA溶液制成样品放入荧光定量PCR仪器中进行 荧光定量检测； 其中， 所述RT‑qPCR反应液的制备如下： 将HCV ‑P、 HCV‑F、 HCV‑R混合制成引物探针混合物， 再 加入Tris ‑HCl、 硫酸铵、 吐温 ‑20、 DEPC处理超纯水混合振荡混匀， 即制备得到RT ‑qPCR反应 液； 所述HCV ‑P为用于靶多核苷酸检测的探针， 其核苷酸序列为SEQ  No.1所示的序列： CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAG； 所述HCV ‑F为用于扩增靶多核苷酸的上游引物， 其核苷酸序 列为SEQ No.2所示的序列： TAGCCGAGTAGTGTTGGGTYG； 所述HCV ‑R为用于扩增靶多核苷酸的 下游引物， 其核苷酸序列为SEQ  No.3所示的序列： TGCACGGTCTACGAGACCTC； 所述用于检测内 对照的探针其核苷酸序列为SEQ  No.5所示的序列： TCACTGACGC CCATCCGTCCTACCT； 所述RT‑PCR酶混合物的制备如下： 将热启动DNA聚合酶、 Revert  AidTMM‑MLV反转录酶 及RiboLockTM核糖核酸酶抑制剂混合， 再加入甘油混匀， 即制得RT ‑PCR酶混合物。 2.根据权利要求1所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述新型生物纳米磁珠的制备方法如下： 将FeC13·6H2O、 FeC12·4H2O、 盐酸、 氨水混合 搅拌反应后磁分离， 将所得到固体物质洗涤 即得Fe3O4； 将所述Fe3O4、 正硅酸四乙酯、 丙三醇 和氨水混合搅拌后磁 分离， 将所得固体物质洗涤即得Fe3O4@SiO2纳米磁珠； 将 尿素在热回流 下与氯甲基三甲氧基硅烷反应， 反应后进 行减压蒸馏， 收集目标馏分即得改性硅烷偶联剂； 将所述Fe3O4@SiO2纳米磁珠分散于无水甲苯中， 搅拌下缓慢加入 所述改性硅烷偶联剂， 搅拌 反应后磁分离， 将所 得固体物质洗涤即得生物纳米 磁珠。 3.根据权利要求1所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述步骤1中， HCV ‑P、 HCV‑F、 HCV‑R、 Tris‑HCl、 硫酸铵、 吐温 ‑20的摩尔比为0.02 ‑0.05: 0.05:0.03:750‑800:150:2。 4.根据权利要求1所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述步骤2中， 热启动DNA聚合酶、 Revert  AidTMM‑MLV反转录酶及RiboLockTM核糖核酸权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287374 A 2酶抑制剂按照摩尔比2.5 ‑5:150‑200:20的比例混合。 5.根据权利要求2所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述FeC13·6H2O、 所述FeC12·4H2O、 所述盐酸、 所述氨 水按体积比4 ‑6:1‑1.5:8‑10:5‑6 的比例混合。 6.根据权利要求2所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述Fe3O4、 所述正硅酸四乙酯、 所述丙三醇和所述氨水按体积比0.01 ‑0.1:1‑5:40‑60: 3‑5的比例混合。 7.根据权利要求2所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述尿素和所述氯甲基三甲氧基硅烷的质量比为1:0.5 ‑1。 8.根据权利要求2所述实时检测丙型肝炎病 毒核酸的荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 所述F e3O4@SiO2和所述改性硅烷偶联剂的质量比为0.1 ‑0.15:1。 9.一种根据权利要求1 ‑8所述的实时检测丙型肝炎病毒核酸的荧光定量PCR检测方法 制备得到的PCR检测试剂盒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287374 A 3