(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210756022.5 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 江苏里下河地区农业科 学研究所 地址 225007 江苏省扬州市扬子江北路5 68 号 (72)发明人 赵仁慧　别同德　万文涛　陈甜甜　 王玲　高德荣　张勇　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 徐冬涛　李晓峰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 小麦成株期抗叶锈病基因Lr16G216的KASP 分子标记、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种小麦成株期抗叶锈病基 因Lr16G216 的KASP分子标记、 检测方法及应用， 属于分子育种技术领域。 与小麦成株期抗叶锈病 基因Lr16G216紧密连锁的KASP分子标记为 Ax109403980和Ax95083494， 上述两个分子标记 与小麦成株期抗 叶锈病基因Lr16G216共定位于 小麦6B染色体长臂上， 二者遗传距离为0.59cM。 相较于常规的分子标记， 本发明提供分子标记不 仅可以高效、 准确、 高通量的检测Lr16G216的遗 传作图群体， 应用于Lr16G216的精细定位和图位 克隆， 还可以进行高通量的分子标记辅助选择， 实现短时间内育种大群体中抗病基因Lr16G216 的高通量筛选， 可有效提高小麦抗叶锈病分子育 种效率。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 115232885 A 2022.10.25 CN 115232885 A 1.小麦成株期抗叶锈病基因Lr16G216在小麦抗叶锈病育种中的应用， 其特征在于， 该 小麦成株期抗叶锈病基因Lr16G216来自抗叶锈病普通小麦品系 ‘扬16G216 ’， 定位于小麦6B 染色体长臂上， 在RefSeqv1.0基因 组版本的物理位置为712.34 –713.94Mb。 2.与小麦成株期抗叶锈病基因Lr16G216紧密连锁的KASP分子标记， 其特征在于， 该 KASP分子标记为Ax109403980和Ax95083494， 所述的KASP分子标记Ax109403980和 Ax95083494与基因Lr16G216共定位于小麦 6B染色体长臂上， 二 者遗传距离为0.59c M。 3.根据权利要求2所述的KASP分子标记， 其特征在于， 所述KASP分子标记Ax109403980 的多态性 为A/G； 所述KAS P分子标记 Ax95083494的多态性 为G/A。 4.根据权利要求2所述的KAS P分子标记， 其特 征在于， 所述的KASP分子标记Ax109403980通过以下3条引物扩增得到， 所述的3条引物包括2条 上游引物和1条通用下游引物， 所述2条上游引物5 ’端分别修饰不同的荧光基团； 3条引物的 核苷酸序列依次分别如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示； 所述的KASP分子标记Ax95083494通过以下3条引物扩增得到， 所述的3条引物包括2条 上游引物和1条通用下游引物， 所述2条上游引物5 ’端分别修饰不同的荧光基团； 3条引物的 核苷酸序列依次分别如SEQ  ID NO.4、 SEQ ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示。 5.如权利要求2所述的KASP分子标记的特异性引 物组合， 其特征在于， Ax109403980含 有核苷酸序列如SEQ  ID NO.1～3所示的引物； Ax95083494含有核苷酸序列如SEQ  ID NO.4 ～6所示的引物。 6.权利要求2、 3或4中所述的KASP分子标记， 或权利要求5中所述的特异性引物组合在 (1)～(3)中至少一种的应用： (1)检测小麦抗叶锈病基因Lr16G216及其精细定位和图位克隆； (2)进行小麦抗叶锈病基因Lr16G216的分子标记辅助选择； (3)鉴定或选 育抗叶锈病小麦品种。 7.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr16G216的方法， 其特征在于， 采用权利要求2、 3或4中 所述的KASP分子标记， 或权利要求5中所述的特异性引物组合对待测小麦样品进行基因型 判定： ①KASP分子标记Ax109403980等位型为AA则为携带基因Lr16G216的纯合抗病的基因 型， 若等位型为G/A则为携带基因Lr16 G216的杂合抗病的基因型， 若等位型为GG则为不携带 Lr16G216的感病基因型； ②KASP分子标记Ax95083494等位型为GG则为携带基因Lr16G216的纯合抗病的基因型， 若等位型为A/G则为携带基因Lr16G216的杂合抗病的基因型， 若等位型为AA则为不携带 Lr16G216的感病基因型。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测小麦叶片的基因 组DNA作为模板； (2)利用所述KASP分子标记Ax109403980和Ax95083494的特异性引物组合分别对待测 样品的基因 组DNA进行PCR扩增， 获得扩增产物； (3)将扩增产物离心， 观察PCR反应板底部， 确保没有气泡； (4)利用荧 光定量PCR检测仪扫描PCR扩增产物基因型， 3 5℃测量荧光信号； (5)利用TaqManGen otyper v1.3.1对扫描结果进行 数据基因型分析；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232885 A 2(6)按照多态性 位点基因分型对待测小麦样品进行基因型判定 。 9.一种鉴定或选育抗叶锈病小麦品种的方法， 其特征在于， 采用权利要求2、 3或4中所 述的KASP分子标记， 或权利要求5中所述的特异性引物组合对待测小麦样品进行基因型判 定， 选择携带基因Lr16G216的抗病小麦样品： ①KASP分子标记Ax109403980等位型为AA则为携带基因Lr16G216的纯合抗病的基因 型， 若等位型为G/A则为携带基因Lr16 G216的杂合抗病的基因型， 若等位型为GG则为不携带 Lr16G216的感病基因型； ②KASP分子标记Ax95083494等位型为GG则为携带基因Lr16G216的纯合抗病的基因型， 若等位型为A/G则为携带基因Lr16G216的杂合抗病的基因型， 若等位型为AA则为不携带 Lr16G216的感病基因型。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232885 A 3