(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692598.X (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 湖南大圣宠医生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市高新 技术产业 开发区谷苑路229号海凭园生产厂房 二301 (72)发明人 毛君杰　范文洲　王洁　汤睿　 邱先锋　罗莎　戴立忠　 (74)专利代理 机构 北京派特恩知识产权代理有 限公司 1 1270 专利代理师 黄景辉　浦彩华 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/43(2006.01) C12R 1/35(2006.01) C12R 1/44(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/725(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (54)发明名称 检测奶牛乳房炎病原体的组合物、 试剂盒、 方法及其用途 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域； 具体地， 涉及奶牛乳房炎病原体的检测； 更具体地， 涉及 乳链球菌、 金黄色葡萄球菌、 乳房链球菌、 凝固酶 阴性葡萄球菌、 停乳链球菌等20种病原体的检 测。 与此同时， 还提供了包含所述组合物的试剂 盒， 所述组合物的用途， 以及用于检测奶牛乳房 炎病原体并分型的方法。 主要利用多重荧光PCR 和熔解曲线分析方法， 对无乳链球菌、 金黄色葡 萄球菌、 乳房链球菌等多种病原体， 在三管内进 行检测， 使得不同病原体能够得到区别对待， 从 而使得治疗和预防更有效。 权利要求书2页 说明书11页 序列表9页 附图16页 CN 115074453 A 2022.09.20 CN 115074453 A 1.一种用于检测奶牛乳房炎病原体并分型的组合物， 其特 征在于， 所述组合物包括： 第一核酸组合物： 如SEQ ID NO:1所示的无乳链球菌上游引物、 如SEQ  ID NO:2所示的无乳链球菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:3所示的无乳链球菌 探针； 如SEQ ID NO:4所示的停乳链球菌上游引物、 如SEQ  ID NO:5所示的停乳链球菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:6所示的停乳链球菌 探针； 如SEQ ID NO:7所示的金黄色葡萄球菌上游引物、 如SEQ  ID NO:8所示的金黄色葡萄球 菌下游引物， 和如SEQ  ID NO:9所示的金黄色葡萄球菌 探针； 和 如SEQ ID NO:10所示的乳房链球菌上游引物、 如SEQ  ID NO:11所示的乳房链球菌下游 引物， 和如SEQ  ID NO:12所示的乳房链球菌 探针； 第二核酸组合物： 如SEQ ID NO:13所示的芽孢杆菌上游引物、 如SEQ  ID NO:14所示的芽孢杆菌下游引 物， 和如SEQ  ID NO:15所示的芽孢杆菌 探针； 如SEQ ID NO:16所示的肠球菌属上游引物、 如SEQ  ID NO:17所示的肠球菌属下游引 物， 和如SEQ  ID NO:18所示的肠球菌属探针； 和 如SEQ ID NO:19所示的鲍曼不动杆菌上游引物、 如SEQ  ID NO:20所示的鲍曼不动杆菌 下游引物， 和如SEQ  ID NO:21所示的鲍曼不动杆菌 探针； 第三核酸组合物： 如SEQ ID NO:22所示的粘质沙雷氏菌上游引物、 如SEQ  ID NO:23所示的粘质沙雷氏菌 下游引物， 和如SEQ  ID NO:24所示的粘质沙雷氏菌 探针； 如SEQ ID NO:25所示的牛棒状杆菌上游引物、 如SEQ  ID NO:26所示的牛棒状杆菌下游 引物， 和如SEQ  ID NO:27所示的牛棒状杆菌 探针； 如SEQ ID NO:28所示的化脓隐秘杆菌上游引物、 如SEQ  ID NO:29所示的化脓隐秘杆菌 下游引物， 和如SEQ  ID NO:30所示的化脓隐秘杆菌 探针； 和 如SEQ ID NO:31所示的支原体属上游引物、 如SEQ  ID NO:32所示的支原体属下游引 物， 和如SEQ  ID NO:33所示的支 原体属探针； 第四核酸组合物： 如SEQ ID NO:34所示 的凝固酶阴性葡萄球菌上游引物和如SEQ  ID NO:35所示的凝固 酶阴性葡萄球菌下游引物； 如SEQ ID NO:36所示 的大肠杆菌上游引物和如SEQ  ID NO:37所示 的大肠杆菌下游引 物； 和 如SEQ ID NO:38所示 的肺炎克雷伯菌上游引物和如SEQ  ID NO:39所示的肺炎克雷伯 菌下游引物； 第五核酸组合物： 如SEQ ID NO:40所示 的铜绿假单胞菌上游引物和如SEQ  ID NO:41所示的铜绿假单胞 菌下游引物； 如SEQ ID NO:42所示 的白色念珠菌上游引物和如SEQ  ID NO:43所示 的白色念珠菌下 游引物； 和 如SEQ ID NO:44所示 的多杀性巴氏杆菌上游引物和如SEQ  ID NO:45所示的多杀性巴权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074453 A 2氏杆菌下游引物； 以及 第六核酸组合物： 如SEQ ID NO:46所示 的牛支原体上游引物和如SEQ  ID NO:47所示 的牛支原体下游引 物； 和 如SEQ ID NO:48所示 的牛原壁菌上游引物和如SEQ  ID NO:49所示 的牛原壁菌下游引 物。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其中， 所述第 四核酸组合物、 第五核酸组合物和第六 核酸组合物还包括如SEQ  ID NO:50所示的内标上游引物和如SEQ  ID NO:51所示的内标下 游引物。 3.根据权利 要求1所述的组合物， 其 中， 所述第二核酸组合物还包括如SEQ  ID NO:52所 示的β‑内酰胺酶抗性基因上游引物、 如SEQ  ID NO:53所示的β ‑内酰胺酶抗性基因下游引 物， 和如SEQ  ID NO:54所示的β ‑内酰胺酶抗 性基因探针。 4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物， 其中， 每一组核酸组合物组内的荧光基 团彼此互不相同且互不干扰。 5.根据权利要求1所述的组合物， 其中， 每一组核酸组合物分别存在于单独包 装中。 6.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测奶牛乳房炎病原体并分型的试剂 盒中的用途。 7.一种检测奶牛乳房炎病原体并分型的试剂 盒， 所述试剂 盒包括权利要求1～5 中任一 项所述的组合物。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒还包括核酸释放试剂、 核酸提取试 剂、 dNTP、 尿嘧啶糖 基化酶、 DNA聚合酶、 PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其中， 所述组合物中引 物的用量为0.05μM～0.15μM； 所述组合物中探针的用量 为0.05 μM～0.15 μM 。 10.一种用于以非诊断目的检测奶牛乳房炎病原体并分型的方法， 所述方法包括以下 步骤： 1)提取或释放待测样本的核酸； 2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或如权利要求7～9中任一项所述的试 剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧 光定量PCR分析； 3)获得并分析 结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115074453 A 3