(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210769300.0 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 江西师范大学 地址 330022 江西省南昌市紫阳 大道99号 (72)发明人 山珊　刘道峰　刘成伟　夏伟诚　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 李冉 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 检测并分型致泻大肠埃希氏菌的多重引物 及应用 (57)摘要 本发明公开了一种可应用于多重PCR结合高 分辨熔解曲线分析技术单孔检测并分型致泻大 肠埃希氏菌方法的多重引物。 本发 明公开了方法 的引物序列及应用， 所述引物序列如SEQ  ID  NO.1～SEQ  ID NO.18所示； 所述引物应用于制备 检测并对致泻大肠埃希氏菌进行分型的试剂盒 中， 方法具有高通量、 低成本、 灵敏度高、 特异性 强、 闭管操作和结果稳定的优势， 为致病菌的快 速准确分型提供新思路。 权利要求书2页 说明书6页 附图9页 CN 115354084 A 2022.11.18 CN 115354084 A 1.一种对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的引物， 其特 征在于， 所述引物序列如下： aggR‑F:CATTAAGACGCCTAAAGGATGC， 如SEQ  ID NO.1所示； aggR‑R:GACCAATTCGGACAACTGCA， 如SEQ  ID NO.2所示； pic‑F:TGGTGGCAATACGAAGTGGA， 如SEQ  ID NO.3所示； pic‑R:GTCACGCAG GTCACCCATAC， 如SEQ  ID NO.4所示； escV‑F:CAATGAGCACGC CACCAA， 如SEQ ID NO.5所示； escV‑R:TGCCAGGAAAGCAAATGAGTA， 如SEQ  ID NO.6所示； stx1‑F:ATCAGGCAGGACACTACTCA ACC， 如AEQ ID NO.7所示 stx1‑R:CAGAGGGGATTTCGTACAACAC， 如SEQ  ID NO.8所示； stx2‑F:TTGACCATCTTCGTCTGAT TATTG， 如SEQ ID NO.9所示 stx2‑R:GGTAGAAAGTATTTGTTGCCGTATT， 如SEQ ID NO.10所示； lt‑F:ACAGGAGGTTTCTGCGTTAGG， 如SEQ ID NO.11所示； lt‑R:AGCTTGGTGATCCGGTGG， 如SEQ ID NO.12所示； sth‑F:TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC， 如SEQ  ID NO.13所示； sth‑R:CGGTACAAGCAGGATTACAACAC， 如SEQ  ID NO.14所示； invE‑F:AGCATC CGAGAACTTGGTATTG， 如SEQ ID NO.15所示； invE‑R:GCCTGAAAGGCACGAGTGA， 如SEQ  ID NO.16所示； uidA‑F:GCGAGGTACGGTAGGAGTTG， 如SEQ ID NO.17所示； uidA‑R:TCACAGC CAAAAGCCAGACA， 如SEQ  ID NO.18所示。 2.根据权利要求1所述的对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的引物， 其特征在于， 所 述引物基于致泻大肠埃希氏菌8种不同的标志性毒力基因aggR、 pic、 escV、 stx1、 stx2、 lt、 sth、 invE、 和大肠埃希氏菌标志基因uidA设计而成； 其中EAEC的特征基因为aggR、 pic、 uidA； EPEC的特征基因为escV、 uidA； STEC的特征基因为stx1、 stx2、 uidA； ETEC的特征基因 为lt、 sth、 uidA； EIE C的特征基因为 invE、 uidA。 3.根据权利要求1 ‑2所述的对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的引物， 制备检测并 对致泻大肠埃希氏菌进行分型 试剂盒中的应用。 4.一种对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的方法， 其特征在于， 检测并分型的过程 包括： (1)提取可疑菌落全基因 组DNA； (2)以提取得到的基因组DNA为模板进行9重PCR扩增， 其 中PCR体系中含饱和荧光染料； 并利用荧光定量PCR仪对扩增产物进行高分辨热熔解曲线分析， 监测不同温度时荧光信号 获得扩增目标产物的熔解曲线， 进 而对致泻大肠埃希氏菌进行分型。 5.根据权利要求4所述的一种 对大肠埃希氏菌进行检测并分型的方法， 其特征在于， 步 骤(2)中， 9重PCR体系为： 加入10 μL  PCR扩增预混液(含聚合酶、 饱和染料及其他扩增所需的 原料)， 一定量的9对引物混合液(所有正向引物和反向引物终浓度均为5 μM)， 1.0 μL可疑单 菌落全基因 组DNA(1ng/ μL或以上)， 最后用去离 子水定容至20 μL。 6.根据利要求4所述的一种对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的方法， 其特征在于， 步骤(2)PCR扩增反应和HRM曲线分析 条件如下： 第一阶段： 热激， 95℃/10mi n；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115354084 A 2第二阶段： 扩增， 95℃/15s， 6 0℃/1min， 40个循环； 第三阶段： HRM分析， 95℃/10s； 60℃/1min； 以0.5～1％的速率升温至95℃， 过程中用 PCR荧光定量仪采集信号； 95℃/15s； 6 0℃/15s。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115354084 A 3