(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210735046.2 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 武汉艾米森生命科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市武汉东湖新 技 术开发区高新大道818号武汉高科医 疗器械园B地块一期B10栋1层04号 (72)发明人 蔡迪　董兰兰　张良禄　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 专利代理师 王秉丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断 产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种检测目标区域的甲基化水 平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用； 目标 区域包括如下定义的区域1或区域1的部分区域 以及区域2或区域2的部分区域中的一个或者多 个： 以GRch38.p14为参考基因组， 区域1为Chr11: 129373212 ‑129373426， 区域2为Chr1:63319773 ‑ 63319944。 以GRch38.p14为参考基因组， 膀胱癌 患者癌组织样本中染色体位置为Chr11: 129373212 ‑129373426和Chr1:63319773 ‑ 63319944区域的甲基化水平显著高于癌旁正常 组织样本。 基于该发现， 发明人通过检测一个或 者多个区域的甲基化水平能有效区分癌症患者 和健康人。 权利要求书1页 说明书16页 序列表5页 CN 115094139 A 2022.09.23 CN 115094139 A 1.检测目标区域的 甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用； 所述目标区域包括如下定义的区域1或区域1的部分区域以及区域2或区域2的部分区 域中的一个或者多个： 以GRch38.p14为参考基因组， 区域1为Chr11:129373212 ‑129373426， 区域2为Chr1: 63319773‑63319944。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述区域1的部分区域为Chr11: 129373242‑129373366； 或/和， 所述区域2的部分区域 为Chr1:63319800‑63319944。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述试剂通过如下方法中的一种或多种实 现对所述目标区域的甲基化水平的检测： 甲基化特异性PCR、 亚硫酸氢盐测序法、 甲基化特 异性微阵列法、 全基因组甲基化测序法、 焦磷酸测序法、 甲基化特异性高效液相层析法、 数 字PCR法、 甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、 甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量 法。 4.根据权利要求1至3任一项所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括检测所述目标区 域的甲基化水平的引物对， 或者还 包括所述引物对 对应的检测探针。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括检测所述区域1和所述区域2 中的一个或者多个的 甲基化引物对和非甲基化引物对； 其中： 所述区域1对应SEQ  ID NO.7和SEQ  ID NO.8所示的 甲基化引物对， 或/和， 所述区域1对应SEQ  ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示的非甲基化引物对， 或/和， 所述区域2对应SEQ  ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的 甲基化引物对， 或/和， 所述区域2对应SEQ  ID NO.13和SEQ  ID NO.14所示的非甲基化引物对。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括检测所述区域1的部分区域 和所述区域2的部 分区域中的一个或者多个的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探 针； 所述区域1的部分 区域对应SEQ  ID NO.19和SEQ  ID NO.20所示的检测引物对和SEQ  ID  NO.21所示的检测探针， 或/和， 所述区域2的部分 区域对应SEQ  ID NO.22和SEQ  ID NO.23所示的检测引物对和SEQ  ID  NO.24所示的检测探针。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述试剂还包括检测内参基因 的检测引物 对和所述检测引物对对应的检测探针， 所述内参基因包括ACTB基因， 所述ACTB基因对应SEQ   ID NO.25和SEQ  ID NO.26所示的检测引物对和SEQ  ID NO.27所示的检测探针。 8.根据权利要求1至3、 5至7任一项所述的应用， 其特征在于， 检测的样本为组织样本或 者尿液样本 。 9.一种膀胱癌诊断试剂盒， 其特 征在于， 包 含权利要求1至8任一项所定义的试剂。 10.根据权利要求9所述的膀胱癌诊断试剂盒， 其特征在于， 所述诊断试剂盒还包括扩 增试剂、 将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、 DNA提取试剂、 DNA纯化试剂和质控 品中的一种或者多种； 可选地， 所述扩增试剂包括扩增缓冲液、 dNTPs、 DNA聚合酶和Mg2+中的 一种或者多种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094139 A 2检测甲基化水平的试剂在制备 膀胱癌诊断产品中的应用以及 膀胱癌诊断试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物医学领域， 具体而言， 涉及一种检测甲基化水平的试剂在制 备膀 胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒。 背景技术 [0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一， 严重威胁着生命健康。 从组织病理学 上讲， 膀胱癌包括尿路上皮膀胱癌、 鳞状细胞癌、 腺细胞癌、 脐尿管癌等。 其中膀胱尿路上皮 癌最为常见， 约占膀胱癌的90％以上。 根据肿瘤是否浸润膀胱肌层， 膀胱癌分为 非肌肉浸润 性疾病(NMIBC)和肌肉浸润性疾病(MIBC)。 几乎80％的膀胱癌表现为非肌肉浸润性疾病， 其 中约60％的疾病局限于膀胱粘膜， 约30％的疾病侵入膀胱粘膜下层， 约10％的疾病表现为 原位癌。 膀胱癌的5年生存率与确诊时的疾病分期有关， 原 位癌的5年生存率高达95.8％， 而 转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6％， 这说明准确、 及时的诊断对于膀胱癌患者的预后是 至关重要的。 [0003]尿液脱落细胞学检查和膀胱镜检查是目前用于诊断膀胱癌的两种主要方式。 尿液 脱落细胞学诊断膀胱癌尤其是低级别 瘤变的灵敏性较低。 膀胱镜检查及病理活检是膀胱癌 诊断的金标准， 也是术后复发监测的主要手段之一； 然而， 膀胱镜检查是一种侵入性手术， 它存在造成尿道穿孔、 出血或感染的风险。 因此， 目前急需高灵敏度、 非侵入性的诊断早期 膀胱癌的方法。 [0004]有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0005]基于此， 本发明实施例的目的包括提供检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断 产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒。 本发明实施例用特定目标区域的甲基化水平的检测 试剂制备膀胱癌诊断试剂盒， 采用该试剂盒能够实现无创、 高灵敏度、 高特异 性的膀胱癌的 诊断。 [0006]在本发明的第一方面， 提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断 产品中的应用； [0007]所述目标区域包括如下定义的区域1或区域1的部分区域以及区域2或区域2的部 分区域中的一个或者多个： [0008]以GRch38.p14为参考基因组， 区域1为Chr11:129373212 ‑129373426， 区域2为 Chr1:63319773‑63319944。 [0009]在本发明的一些实施方式中， 所述区域1的部分区域为Chr11:129373242 ‑ 129373366； 或/和， 所述区域2的部分区域 为Chr1:63319800‑63319944。 [0010]在本发明的一些实施方式中， 所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述 目标区域的甲基化水平的检测： 甲基化特异性PCR、 亚硫酸氢盐测序法、 甲基化特异性微阵说　明　书 1/16 页 3 CN 115094139 A 3