(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211198005.0 (22)申请日 2022.09.29 (71)申请人 南京师范大学 地址 210097 江苏省南京市 鼓楼区宁海路 122号 (72)发明人 张凯　唐鹏　邢秀梅　许伟鹤　 张雯雯　暨杰　尹绍武　 (74)专利代理 机构 南京众联专利代理有限公司 32206 专利代理师 许小莉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及 风险评估方法 (57)摘要 本发明公开了一种水产养殖中抗生素抗性 基因的定量检测及风险评估 方法， 该方法包括如 下步骤： S1.样品水样的采 集与总DNA提取； S2.制 备目标DNA标准品， 并建立实时荧光定量PCR的标 准曲线； S3.根据实时荧光定量PCR的标准曲线得 到养殖环境水体和养殖生物中的ARGs绝对丰度， 并将不同种ARGs的绝对丰度构建ARGs样本数据 集； S4.对ARGs样本数据集进行数据误差缩小处 理得到ARGs数据误差缩小处理值； S5.对ARGs数 据误差缩小处理值进行风险赋值， 得到ARGs风险 评分， 再根据单个ARGs风险评分， 计算ARGs总风 险评分。 本发 明在水产养殖环 境检测中适用范围 广， PCR扩增效率高， 测量 准确度高。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 115537469 A 2022.12.30 CN 115537469 A 1.一种水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法， 其特征在于， 该方法 包括如下步骤： S1.样品水样的采集与总DNA提取； S2.制备目标DNA标准品， 并建立实时荧 光定量PCR的标准曲线； S3.根据步骤S2建立的实时荧光定量PCR的标准曲线得到养殖环境水体和养殖生物中 的ARGs绝对丰度， 并将不同种ARGs的绝对丰度构建为具备X个元素的一组样 本数据， 即ARGs 样本数据集； S4.对步骤S3中得到的ARGs样本数据 集进行数据 误差缩小 处理得到ARGs数据 误差缩小 处理值； S5.对步骤S4 中得到的ARGs数据误差缩小 处理值进行风险赋值， 得到A RGs风险评分， 再 根据单个ARG s风险评分， 计算ARG s总风险评分。 2.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法， 其 特征在于， 步骤S1所述样品水样的采集与总DNA提取的具体方法包括如下步骤： S1‑1.采用高温高压灭菌的采水器采集距离水面5 0cm处的水体作为样本水样； S1‑2.待水样沉淀， 用装有0.22 μm微孔滤膜的真空抽滤装置进行抽滤， 取出滤膜装至灭 菌离心管中， 液氮速冻3 ‑5min， 然后转移至 ‑80℃冰箱中保存待测 S1‑3.将滤膜取出后， 用高温高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎， 采用E.Z.N.A.TMWater DNA  Kit(Omega， 美国)DNA提取 试剂盒提取和纯化样本总DNA。 3.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法， 其 特征在于， 步骤S2 中所述制备 目标DNA标准品， 并建立实时荧光定量PCR的标准曲线的具体 方法是： S2‑1.通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段： 以抗生素抗性基因阳性菌株所提取的基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段， 其中PCR反应 体系共20 μL， 包括： 2x Rapid Taq Master Mix 10 μL； 浓度为10 μM的上游引物0.8 μL； 浓度为10 μM的下游引物0.8 μL； ddH2O 7.4 μL； 模板DNA 1 μL； 反应程序为： 预变性： 95℃  5min； 变性： 95℃  30s， 退火： 58℃  30s， 延伸： 72℃  30s， 35 个循环； 72℃  5min； 所述上游引物和下游引物和荧 光定量PCR采用相同引物序列， 为： tetx： 上游引物： A AATTTGTTACCGACACGGAAGTT 下游引物： CATAGCTGA AAAAATCCAGGACAGTT sul1： 上游引物： CGCAC CGGAAACATCGCTGCAC 下游引物： TGA AGTTCCGCCGCAAGGCTCG sul3：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537469 A 2上游引物： TC CGTTCAGCGAATTGGTGCAG 下游引物： T TCGTTCACGCCTTACACCAGC cmlA： 上游引物： GT TGGCGGTACTCCCTTGCC 下游引物： G GCCACCTCCCAGTAGAACG S2‑2.切胶回收耐药基因的PCR产物； S2‑3.将回收的PCR产物与克隆载体连接成环状质粒， 转 化至感受态细菌进行 克隆； S2‑4.通过蓝白实验筛 选阳性克隆子， 分离纯化后提取质粒； S2‑5.梯度稀释标准质粒制备荧 光定量PCR标准曲线。 4.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法， 其 特征在于， 步骤S4所述对步骤S3中得到的ARGs样 本数据集进行数据误差缩小处理得到ARGs 数据误差缩小处 理值的公式是： 其中， 为ARGs样本数据集中第t种ARGs的数据误差缩小处理值， 为ARGs样 本数据集中第t种ARGs的水体绝对丰度， 为ARGs样本数据集中第t种ARGs的养殖生物 指标之一 绝对丰度， 为ARGs样本数据集中第t种ARG s的养殖生物指标之二 绝对丰度。 5.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法， 其 特征在于， 步骤S5的具体方法是： S5‑1： 对ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值， 得到ARGs风险评分， 对ARGs数据误差 缩小处理值进行风险赋值的公式为： 其中， 为第t类ARGs数据误差缩小处理值的风 险评分， 第t类ARGs数据误差 缩小处理值的风险系数， 为ARGs样本数据集中第t种ARG s的数据误差缩小处 理值； S5‑2： 根据单个ARG s风险评分， 计算ARG s总风险评分， 计算公式为： 其中， SARGs为ARGs总风险评分， t为ARGs的种类 数， 为第t类ARGs数据误差缩小处理 值的风险评分。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537469 A 3