(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210632945.X (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 青岛啤酒股份有限公司 地址 266023 山东省青岛市 市北区登州路 56号 (72)发明人 贺扬　尹花　余俊红　侯晓平　 万秀娟　赵玉祥　陈嵘　胡淑敏　 (74)专利代理 机构 青岛清泰联信知识产权代理 有限公司 3725 6 专利代理师 段晓菲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 用于判定酵母絮凝性强弱的引物、 试剂盒及 方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于判定酵母絮凝性强 弱的引物、 试剂盒及方法， 属于酵母检测领域。 其 技术方案包括包括测序比对步骤， 所述测序比对 步骤包括对测序结果进行比对， 且酵母菌株中 FLO11‑Sc基因的扩增产物存在如SEQID  NO.3所 示的171bp的插入片段的为强絮凝酵母菌株； 酵 母菌株中FLO11 ‑Sc基因的扩增产物缺少该17 1bp 的插入片段的为弱絮凝酵母菌株。 本发明应用于 Lager酵母絮凝性强弱方面， 解决现有通过基因 手段对Lager酵母的絮凝性强弱进行评价时， 因 Lager酵母的多样化， 无法对不同酵母菌株进行 絮凝性差异判断的问题， 可以在选育阶段提前评 估酵母絮凝能力， 提升选育效率， 从而节约时间 和成本。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 CN 114959097 A 2022.08.30 CN 114959097 A 1.一种用于判定酵母絮凝性强弱的引物， 其特征在于， 根据L ager酵母絮凝基因FLO11 ‑ sc设计上、 下游引物， 引物序列如下： 基因名称 引物序列 FLO11‑sc FW SEQ ID NO.1 FLO11‑sc RV SEQ ID NO.2 。 2.根据权利要求1所述的用于判定酵母絮凝性强弱的引物， 其特征在于， 所述引物的设 计包括： 查找模式菌酿酒酵母S.cerevisiae中絮凝基因FLO11 ‑sc， 通过BLASTn序列比对， 查找 在S.pastorianus  TT‑21基因组中的同源基因序列； 利用已测序的Lager酵母TT ‑21的基因信息， 对不同来源( ‑Sc/‑Sb)的同一基因进行 CLUSTAL W比对， 寻找非同源区段分别进行引物设计， 且使非同源区段位于引物的3 ’末端。 3.根据权利要求1所述的用于判定酵母絮凝性强弱的引物， 其特征在于， 所述引物的设 计时需要满足： 为获得较长的PCR产物以进行不同酵母菌株之间的比对， 上、 下游引物尽可 能靠近基因序列的两端， Tm值 为55‑65℃， 避免引物的二级结构和错配。 4.一种试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1 ‑3任一项所述的用于判定酵母絮凝性强 弱的引物。 5.一种利用权利要求1 ‑3任一项所述的引物判定酵母絮凝性强弱的方法。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 包括测序比对步骤， 所述测序比对步骤包 括对测序结果进行比对， 且 酵母菌株中FLO11 ‑Sc基因的扩增产物存在如SEQ  ID NO.3所示 的171bp的插入片段的 为强絮凝酵母菌株； 酵母菌株中FLO1 1‑Sc基因的扩增产物缺少该171bp的插 入片段的为弱絮凝酵母菌株。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 在所述测序比对步骤之前还包括： 引物配 制步骤、 模板DNA稀释步骤、 PCR反应步骤、 琼脂糖电泳检测步骤。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 还 包括Lager酵母菌株DNA的提取步骤。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述引物配制步骤包括： 将所述引物溶于 10mM Tris‑HCl， pH 8.0， 配置成10 0 μM的引物储 存液， 进一 步稀释到10 μM作为工作液。 10.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 模板DNA稀释步骤包括将DNA样品到 10ng·μL‑1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959097 A 2用于判定酵母絮凝性强弱的引物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于酵母检测领域， 尤其涉及一种用于判定酵母絮凝性强弱的引 物、 试剂 盒及方法。 背景技术 [0002]啤酒是一种深受人们喜爱的低酒精含量且营养丰富的饮料。 当今全球啤酒市场超 过90％是Lager类型的啤酒， 因此用于酿制Lager啤酒的下面啤酒酵母(俗称 “Lager酵母 ”或 “巴氏酵母 ”)已被最广泛地应用在啤酒工业中。 酵母絮凝是酵母细胞从介质中由悬浮状态 聚集成团的现象。 Lager酵母会在主酵结束后快速沉降到发酵罐底部。 在酵母的诸多性能 中， 絮凝性是贯穿啤酒发酵过程始终的一项极其重要的性能指标， 在发酵各个阶段， 酵母细 胞数都应保持在相对稳定的范围内， 才能保证啤酒生产的正常运行， 进而保证发酵 的一致 性和产品口味质量的稳定性， 因此酵母的絮凝性与酵母表现出的发酵性能、 代谢产物的生 成和还原等生化反应息息相关， 在啤酒酿造过程中酵母絮凝性能的异常波动会严重影响产 品的口味和生产效率。 因此， 絮凝性是 啤酒酵母的一个重要特性。 对于啤酒制造来说， 啤酒 酵母细胞的絮凝能力是评价菌种性能优劣的一个关键指标。 [0003]酵母菌种不同 ， 其生理特性存在差异， 絮凝性的强弱也不同。 酿酒酵母 (S.cerevisiae)的絮凝性是由其遗传背景决定的。 参与絮凝蛋白的表达的基因有多个(包 括FLO1， FLO2， FLO4， FLO5， FLO8， FLO9， FLO10， FLO11等)， 形成了絮凝蛋白基因家族。 研究发 现， 在不同的酵母菌株其絮凝家族的基因组成上存在差异， 其中研究得最为详尽的是酿酒 酵母中的FLO1， 其ORF约4.6Kb， 中间部分有大量重复序列， 编码一个富含Ser/Thr的由1537 个氨基酸组成的絮凝蛋白(Flo1p)。 不同于酿酒酵母(S.cerevisiae)， 工业Lager酵母 S.pastorianus菌株是一种具有高度染色体倍性、 染色体结构组成复杂的异源多倍体酵母 菌株。 对于Lager酵母S.pastorianus， 在不同的工业环境中经过了长期使用及不断驯养， 导 致了菌株的基因组都发生了不同程度的改变， 从而衍化出了工业Lager酵母S.pastor ianus 菌株的特殊性及复杂性， 这也是不同工业Lager酵母S.pastorianus菌株絮 凝性、 发酵性能 及风味特点多样化的本质原因。 [0004]通过Lager酵母絮凝基因序列判断酵母菌株絮凝性的强弱极其重要， 可以快速的 了解菌株的絮凝特性。 但由于酵母中絮凝性由多基因家族决定， 基因数量多， 且基因较长 (～4Kb)； 且不同基因之间的序列相 似性较高， 基因内部还存在大量重复片段， 这都为基因 检测的引物设计工作增加了难度； 尤其是针对Lager酵母， 其含有不同来源的基因拷贝( ‑ Sc/‑Sb)， 且序列相似性较高， 且同一来源的基因也可能存在多个拷贝， 因此基因检测 工作 的难度加大。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的不足之处， 本发明所要解决的技术问题是克服现有通过基 因 手段对Lager酵母的絮凝性强弱进行评价时， 因Lager酵母的多样化， 无法对不同酵母菌株说　明　书 1/6 页 3 CN 114959097 A 3