(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210616324.2 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 上海市生物医药技 术研究院 地址 200032 上海市徐汇区斜土路2140号 (72)发明人 张天成　沈晓蓉　吴斌　施惠娟　 (74)专利代理 机构 上海新隆知识产权代理事务 所(普通合伙) 31366 专利代理师 刘兰英 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于实施免疫组库测序的组合物及试剂盒 和测序方法 (57)摘要 一种用于实施免疫组库测序的组合物， 包括 如SEQ ID NO:1所示逆转录引物， 含有如SEQ  ID  NO:17所示序列的链置换引物， 第一PCR引物对， 用于装在T n5转座酶的核 酸： 如SEQ  ID NO:3所示 接头Tn‑A和SEQ ID NO:4所示的嵌合端； 以及第 二PCR引物对。 本发明的核酸组合物适用于以短 读长测序平台对全长适应性免疫组库进行测序， 只需要构建一个文库即可利用短读长的测序数 据组装出完整的BCR和TCR全长序列， 有效降低测 序的成本， 进一步提高测序的通量， 提高测序效 率。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114934096 A 2022.08.23 CN 114934096 A 1.一种用于实施免疫组库测序的组合物， 其特 征在于包括： 逆转录引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 链置换引物， 含有如SEQ  ID NO:17所示核酸序列， 以及随机序列标签； 第一PCR引物对， 上游引物如SEQ  ID NO:2所示， 下游引物选自于SEQ  ID NO:6～SEQ  ID  NO:14之一种或几种； 用于装在Tn5转座酶的核酸， 如SEQ  ID NO:3所示接头Tn ‑A， 以及SEQ  ID NO:4所示的嵌 合端； 第二PCR引物对， 含SEQ  ID NO:15所示的上游引物， 含SEQ  ID NO:16下游引物。 2.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物， 其特征在于所述的链置换 引物3’末端含有3～5个修饰的G。 3.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物， 其特征在于所述的 acacgacgctcttccgatct‑nnnnnnnn‑rgrglnag， 其中， n nnnnnnn表示随机序列标签。 4.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物， 其特征在于第 二PCR引物的 上游引物为： a atgatacggcgaccaccgagatctacac ‑8bp barcode‑tcgtcggcagcgtcagatgt。 5.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物， 其特征在于第 二PCR引物的 下游引物为： ca agcagaagacggcatacgagat‑8bp barcode‑gtctcgtg ggctcggagatg。 6.根据权利要求1所述的用于实施免疫组库测序的组合物， 其特征在于还包括如SEQ   ID NO:5所示的接 头Tn‑B。 7.根据权利要求1～6之一所述的用于实施免疫组库测序的组合物用于以短读长测序 平台对全长适应性免疫组库进行测序。 8.一种用于实施免疫组库测序的试剂 盒， 其特征在于包括权利要求1～6之一所述的组 合物。 9.根据权利要求8所述的用于实施免疫组库测序的试剂 盒， 其特征在于还包括说明书， 其上记载的实施测序的方法包括： 逆转录模板制备： 收集待测试的外周血， 加入终浓度1 ‑10倍体积的固定液， 10～40℃孵 育5～60分钟； 接着加入1～20倍体积的裂解液， 25～42℃孵育5 ‑40分钟； 然后300～2000g离 心3～10分钟， 收集细胞沉淀， 清洗2 ‑3次， 得到细胞沉淀用作逆转录模板； 逆转录反应： 在逆转录模板中加入逆转录引物和链置换引物， 进行逆转录反应， 逆转录 条件为： 5 0～60℃， 3～10分钟， 然后37～42℃， 3 0～120分钟， 再 70～80℃， 10～ 20分钟； 第一次PCR条件为： 94～98℃ 变性5～10min， 然后依次于94～98℃， 20～60秒； 于55～60 ℃， 5～15秒； 于68 ‑72℃， 30～120秒为一 次循环， 循环25 ‑35次后， 再于68 ‑72℃， 5‑10分钟， 得到PCR产物； 第二次PCR反应条件为： 94～98℃变性5 ‑10分钟后， 依次于94～98℃， 20 ‑60秒； 于55～ 60℃， 5‑15秒； 以及于68～72℃， 30～120秒为一个循环， 循环2 5‑35次后， 再于68～72℃， 5～ 10分钟； 产物纯化： 可通过磁珠 纯化的手段对PCR产物实施纯化。 10.一种以权利要求1～6之一所述的组合物实施适应性免疫组库测序方法， 其特征在 于包括如下步骤： 先采用4％多聚甲醛固定液加入的体积为外周血体积的一倍， 25℃孵育15分钟， 再加入权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934096 A 2裂解液为含0.1％的Triton ‑100的无RNA酶PBS， 其加入体积为外周血的10倍， 于72℃， 裂解 20分钟以制备逆转录模板； 然后， 在逆转录模板 中加入逆转录引物和链置换引物， 进行逆转录反应， 获得逆转录反 应产物； 接着， 以所得的逆转录反应产物为模板， 以第一PCR引物对进行第一次PCR反应， 其中上 游引物如SEQ  ID NO:2所示， 下游引物选自于SEQ  ID NO:6～SEQ  ID NO:14之一种或几种， 取得PCR产物； 之后， 将用于装在Tn5转座酶的核酸预先退火， 等比例混合， 再与Tn5转座酶混匀， 制备 装载测序接头的Tn5转座 酶， 形成装 载接头的Tn5转座 酶后， 加入纯化的PCR产物， 将P CR产物 片段化； 最后， 以片段化PCR产物为模板， 进行第二次PCR反应， 获得扩增文库， 纯化并分选获得 300‑700bp的DNA片段， 定量后作为模板上机测序， 经测序 产物可以组装为全长序列。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934096 A 3