(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210920865.4 (22)申请日 2022.08.02 (71)申请人 天根生化科技 （北京） 有限公司 地址 100192 北京市海淀区西小口路6 6号 东升科技园 （北 领地） C7- 3 (72)发明人 张双宇　刘玉方　李晓晨　孙克非　 (74)专利代理 机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11201 专利代理师 于腾昊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测CHO细胞基因组DNA的组合物、 试剂 盒及方法 (57)摘要 本发明提出了用于检测CHO细胞基因组DNA 的组合物、 试剂盒及方法， 该组合物包括引物和 探针， 所述引物包括： 上游引物序列： 5 ’‑ CTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTA ‑3’(SEQ ID NO:2)， 下 游引物序列： 5 ’ ‑CCAGCACTCGGGAGGCA ‑3’(SEQ ID  N O : 3 ) ； 所 述 探 针 包 括 如 下 序 列 ： 5 ’‑ ACTCACAGAGATCCGCCTGCC ‑3’(SEQ ID NO:4)。 利 用本发明提出的组合物可以排除Vero细胞、 大鼠 细胞、 小鼠细胞、 大肠杆菌细胞和人源细胞的基 因组DNA的干扰， 能够有效检测生物制品中残留 CHO细胞基因 组DNA， 稳定 检测灵敏度可达1fg。 权利要求书1页 说明书16页 附图4页 CN 115418394 A 2022.12.02 CN 115418394 A 1.一种组合物， 其特 征在于， 包括引物和探针， 所述引物包括： 上游引物序列： 5 ’ ‑CTCTGTGTAGCT TTGGAGCCTA‑3’(SEQ ID NO:2)， 下游引物序列： 5 ’ ‑CCAGCACTCG GGAGGCA‑3’(SEQ ID NO:3)； 所述探针包括如下序列： 5 ’ ‑ACTCACAGAGATC CGCCTGCC‑3’(SEQ ID NO:4)。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述探针进一 步携带荧 光基团； 任选地， 所述荧光基团选自下列中的至少之一： FAM、 ROX、 VIC、 CY5、 CY3、 HEX、 5 ‑TAMRA、 TET和JOE 。 3.根据权利要求2所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标 记淬灭基团， 任选地， 所述探针5 ’端标记FAM荧 光报告基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 包 含权利要求1 ‑3任一项所述的组合物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 进一步包括下列中的至少一种： PCR缓冲 液、 盐离子、 dNTPs、 DNA聚合酶 或者靶标核酸； 任选地， 进一 步包括PCR增强剂； 任选地， 所述DNA聚合酶为Taq酶； 任选地， 所述盐离 子为Mg2+。 6.根据权利要求4或所述的试剂盒， 其特征在于， 进一步包括下列试剂中的至少一种： DNA提取试剂和核酸纯化试剂。 7.一种检测C HO细胞基因 组DNA的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应， 所述PCR扩增体系中包括权利要求1 ‑3任 一项所述的组合物或利用权利要求 4‑6任一项所述的试剂盒配制的， 其中， 所述待测样品包括C HO细胞基因 组DNA。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述待测样品是以C HO细胞的形式提供的； 任选地， 所述待测样品预 先经过CHO细胞基因 组DNA提取处 理； 任选地， 在PCR扩增体系中进行扩增反应， 以便获得靶标核酸的CT值； 以及基于所述靶 标核酸的CT值， 确定待测样品中C HO细胞基因 组DNA的水平； 任选地， 所述靶标核酸包括SEQ  ID NO:1所示的核苷酸序列。 9.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增体系包括权利要求1 ‑3任一 项所述的组合物， 其中， 所述组合物中的上游引物序列、 下游引物序列和探针的摩尔比为 (4‑10)： (4‑10)： (3‑6)； 优选地， 所述上游引物序列、 下游引物序列和探针的摩尔比为5： 5： 4。 10.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增反应的条件依次为： 90℃ ‑97 ℃、 0.8‑1.5min， 1个循环； 90℃ ‑97℃、 3‑10s， 55‑65℃、 10‑20s， 38‑42个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115418394 A 2用于检测CHO细胞基因组DNA的组合物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及用于检测CHO细胞基因组DNA的组合物、 试 剂盒及方法， 更 具体地， 设计一种组合物、 试剂盒、 检测C HO细胞基因 组DNA的方法。 背景技术 [0002]CHO细胞， 中 国仓鼠卵巢细胞(Chinese  hamster ovary)， 由于具有无限增殖能力， 可稳定传代百代以上， 而成为目前生物工程上广泛使用的哺乳动物细胞系。 现阶段， CHO细 胞与大肠杆菌细胞被广泛用于人类疾病治疗和预防基因工程产品的生产， 在已经批准的产 品中， 使用这两种细胞表达的产品占比达90％以上。 CHO细胞与大肠杆菌细胞相比， 其最大 的优势在于CHO细胞是真核哺乳动物细胞， 具有形成复杂高级结构蛋白的能力和糖基化修 饰能力， 从而使得CHO细胞成为表达复杂生物大分子的理想宿主， 是一种重要的， 应用广泛 的生物工程表达细胞株。 [0003]重组生物制品绝大多数由大规模的基 因改造工程宿主细胞生产， 细胞中复杂的非 目标产物是终产物中主要的杂质来源， 直接影响生物制品的安全性。 其中， 残 余的生物遗传 物质DNA是一个非常重要的污染， 因此， 对它的检测是重要的质量控制环 节。 [0004]在重组生物蛋白制品中， 残余D NA多来源于培养的宿主细胞， 这些宿主细胞多为外 源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。 理论上， 存在于生物制品中的微量DNA杂质， 都有可能 传递与肿瘤或病毒相关的基因， 并导致癌变或其它病理变化。 当一定量的残留DNA与制品一 同进入人体后， 含有致癌基因的DNA片段就可能诱 发肿瘤的产生； 如果生物制品中含有某些 可以整合病毒的DNA， 则这种DNA通过表达后具 备感染性， 从而导 致一系列的不良后果。 [0005]CHO细胞属于传代细胞系， 易于培养， 适合大规模工业生产， 是常用的人用蛋白药 物制备的细胞基质之一。 因此， 以CH O细胞为基质生产的蛋白药物的主要风险在于蛋白药物 中残留的宿主基因组DNA具有潜在的肿瘤致病性。 所以， 建立准确的生物制品中CHO细胞残 留基因组DNA的定量方法对于蛋白药物的安全性和质量控制至关重要。 [0006]现阶段， 世界卫生组织推荐的标准是每剂 量制品中的终D NA含量必须小于 10ng； 美 国FDA建议使用检测灵敏度达到100pg的检测方法检测制品中的DNA水平； 且规定每剂量疫 苗中的CHO细胞基因组DNA的残留量必须小于100pg。 而随着科技的发展和人们对健康要求 越来越高这个大趋势来看， 上述对CHO细胞基因组DNA残留的安全量标准也会变得越来越 高。 因此， 这就需要高效的， 高灵敏度的引物、 探针以及检测试剂来检测生物制品中残留的 CHO细胞基因 组DNA。 [0007]迄今为止， 常用的技术一般是针对CHO细胞基因组中的高拷贝序列设计引物和探 针， 经过一段时间的发展， 应用此方法设计的引物和探针以及检测方法已经达到了较高的 检测灵敏度， 最高可达1fg， 但低浓度样品定量结果不稳定， 误差较大。 因此， 现有方法已经 不能满足人们对检测灵敏度和检测稳定性要求越来越高的标准。 另外， 由于CH O基因组与人 源细胞， 小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的同源性很高， 一些方法设计的引物并不能很好 的排除来自于人源细胞， 小鼠源细胞和大鼠源细胞基因组的干扰， 使得检测结果不准确的说　明　书 1/16 页 3 CN 115418394 A 3