(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210612202.6 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 刘丽　袁丽娜　冯悦　夏雪山　 (74)专利代理 机构 昆明同聚专利代理有限公司 53214 专利代理师 苏芸芸 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/01(2006.01)C12R 1/46(2006.01) C12R 1/365(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多 重荧光定量PCR检测试剂 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测中枢神经系统 感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂， 其 特征在于： 包括检测EB病毒、 流感嗜血杆菌、 巨细 胞病毒、 单纯疱疹病毒2型、 水痘带状疱疹病毒、 钩端螺旋体、 B ‑溶血性链球菌、 诺卡菌的特异性 引物和探针； 该方法具有特异性强、 灵敏度高、 反 应快速且应用范围广的优点， 大幅度提升了检测 的速度并节约成本， 可广泛应用于脑炎脑膜炎等 各种中枢神经系统感染性疾病常见病原体的检 测， 提高病原体的检出率， 对临床诊断中枢神经 系统感染性疾病意 义重大。 权利要求书1页 说明书8页 序列表7页 附图12页 CN 114990260 A 2022.09.02 CN 114990260 A 1.一种用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂， 其特征在 于： 包括检测EB病毒、 流 感嗜血杆菌、 巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒2型、 水痘带状疱疹病毒、 钩 端螺旋体、 B‑溶血性链球菌、 诺卡菌的特异性引物和探针； 所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2、 针对流感嗜血杆菌的 SEQ ID NO:4和SEQ  ID NO:5、 针对巨细胞病毒的SEQ  ID NO:7和SEQ ID NO:8、 针对单纯疱 疹病毒2型的SEQ  ID NO:10和SEQ  ID NO:11、 针对水痘带状疱疹病毒的SEQ  ID NO:13和SEQ   ID NO:14、 针对钩端螺旋体的SEQ  ID NO:16和SEQ  ID NO:17、 针对B ‑溶血性链球菌的SEQ   ID NO:19和SEQ  ID NO:20； 针对诺卡菌的SEQ  ID NO:22和SEQ ID NO:23； 所述探针为针对EB病毒的SEQ  ID NO:3、 针对流感嗜血杆菌的SEQ  ID NO:6、 针对巨细 胞病毒的SEQ  ID NO:9、 针对单纯疱疹病毒2型的SEQ  ID NO:12、 针对水痘带状疱疹病毒的 SEQ ID NO:15、 针对钩端螺旋体的SEQ  ID NO:18、 针对B ‑溶血性链 球菌的SEQ  ID NO:21； 针 对诺卡菌的SEQ  ID NO:24。 2.根据权利要求1所述用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测 试剂， 其特征在于： 检测  EB病毒、 流 感嗜血杆菌、 巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒2型的特异 性引 物和探针同时使用； 检测水痘带状疱疹病毒、 钩端螺旋体、 B ‑溶血性链球菌、 诺卡菌的特异 性引物和探针同时使用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990260 A 2用于检测中枢神经系统感 染性病原体的多重荧光定量PCR检 测试剂 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 针对引发中枢神经系统感染性疾病常见8种病原体， 建 立特异性强、 灵敏度高、 反应快速的多重荧 光定量PCR检测方法。 背景技术 [0002]中枢神经系统 （Central  Nervous System， CNS） 感染性疾病指的是细菌、 病毒、 真 菌等病原体侵犯CNS的脑膜、 实质、 血管导致的慢性或急性炎症或非炎症性的疾病。 中枢神 经系统感染性疾病有三种不同的分类， 临床上依据中枢神经系统感染部位的不同可分为： （1） 脑炎、 脊髓炎或脑脊髓炎， 病原体主要侵犯脑和(或)脊髓实质， 其中最常见的疾病为脑 炎， 据报道感染性脑炎的发病率为1.5 ‑7例/100000人/年。 （2） 脑膜炎、 脊膜炎或脑脊膜炎， 主要侵犯脑和(或)脊髓软膜， 其中脑膜炎是最常见的CNS感染性疾病， 脑膜有三层， 由外向 内为硬脑膜、 蛛网膜和软脑膜。 脑膜炎可累及硬脑膜、 蛛网膜和软脑膜， 目前临床上的脑膜 炎实际上是指软脑膜炎。 脑膜炎是一类特别严重的疾病， 需要及时治疗， 如果治疗不及时， 可能会造成死亡或留下一些后遗症。 （3） 脑膜脑炎指的是脑膜与 脑实质合并感染。 脑膜脑炎 是一种病毒性疾病， 发生在蛛网膜和软脑膜之间。 确定了CNS感染性疾病常见的8种病原体 有EB病毒 （Epstein ‑Barr Virus， EBV） 、 猿猴空泡病毒40 （Simian  Vacuolating  Virus  SV40）、 2型单纯疱疹病毒 （Herps  Simplex  Virus 2， HSV‑2）、 水痘带状疱疹病毒 （Varicella ‑Zoster Virus， VZV）、 巨细胞病毒 （Cytomegalovirus， CMV）、 诺卡菌 （Nocardiosis） 、 流感嗜血杆菌 （Haemophilus  influenzae） 、 B ‑溶血性链球菌 （ β ‑ Streptococ cus haemolyticus） 、 钩端螺 旋体 （Leptospira） 等会导 致严重的后果。 [0003]病毒感染是人类中枢神经系统感染的主要原因， 在儿童群体中感染率最高。 CNS的 真菌感染可能是毁灭性的并且难以治疗， 相关死亡率超过90%。 细菌感染可能会致命或在幸 存者中留下严重的CNS后遗症。 快速准确的检测中枢神经系统的病原体对疾病的治疗是非 常必要的。 目前常用的脑脊液病原体的检测方法存在一些弊端， 比如脑脊液病原体分离培 养法培养时间长 （2 ‑5天） ， 很多病原体要求的培养条件非常严格， 可能会延误病情， 错过最 佳治疗时期， 且检测灵敏度低。 免疫 学检测和普通P CR的方法对病原体的检测也 都有灵敏度 低的特点。 近几年新兴的基因芯片法和mNGS的方法虽然检测灵敏度很高， 但 价格昂贵， 且需 要专业人员操作。 发明内容 [0004]针对现有技术的不足， 本发明提供了一种用于检测中枢神经系统感染性病原体的 多重荧光定量P CR检测试剂， 其包括检测EB病毒、 流 感嗜血杆菌、 巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒 2型、 水痘带状疱疹病毒、 钩端螺旋体、 B ‑溶血性链球菌、 诺卡菌的特异性引物和 探针； 包括 GAPDH基因的引物和探针； 还包括多重荧光定量PCR检测的其他常规试剂； 本发明检测试剂 具有检测灵敏度高、 特异 性强、 重复性良好， 对仪器 设备要求不高、 操作简 便、 所需时间短等说　明　书 1/8 页 3 CN 114990260 A 3