(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210612569.8 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 冯悦　刘文锋　刘丽　夏雪山　 (74)专利代理 机构 昆明同聚专利代理有限公司 53214 专利代理师 苏芸芸 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/35(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/21(2006.01) (54)发明名称 用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重 qPCR检测试剂 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测呼吸道感染性 疾病病原体的多重qPCR检测试剂， 其包 括检测EB 病毒、 流感嗜血杆菌、 肺炎支原体、 肺炎链球菌、 卡他莫拉菌、 巨细胞病毒、 呼吸道合胞病毒、 鼻病 毒、 乙型流感病毒的特异性引物和探针； 本发明 利用实时荧光定量PCR技术对病原体靶基因进行 检测； 该方法具有耗时短、 特异性高、 成本低， 一 次可检测多种病原体的优点， 为呼吸道感染性疾 病病原体的检测提供了便捷 方法， 对呼吸道感染 患者临床早期分子诊断具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书9页 序列表7页 附图10页 CN 114990261 A 2022.09.02 CN 114990261 A 1.一种用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂， 其特征在于： 包括检 测EB病毒、 流感嗜血杆菌、 肺炎支原体、 肺炎链球菌、 卡他莫拉菌、 巨细胞病毒、 呼吸道合胞 病毒、 鼻病毒、 乙型流感病毒的特异性引物和探针； 所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2、 针对流感嗜血杆菌的 SEQ ID NO:4和SEQ  ID NO:5、 针对肺炎支原体的SEQ  ID NO:7和SEQ ID NO:8、 针对肺炎链 球菌的SEQ  ID NO:13和SEQ ID NO:14、 针对卡他莫拉菌的SEQ  ID NO:16和SEQ ID NO:17、 针对巨细胞病毒的SEQ  ID NO:19和SEQ  ID NO:20、 针对呼吸道合胞病毒的SEQ  ID NO:22和 SEQ ID NO:23、 针对乙型流感病毒的SEQ  ID NO:25和SEQ  ID NO:26、 针对鼻病毒的SEQ  ID  NO:28和SEQ  ID NO:29； 所述探针为针对EB病毒的SEQ  ID NO:3、 针对流感嗜血杆菌的SEQ  ID NO:6、 针对肺炎 支原体的SEQ ID NO:9、 针对肺炎链球菌的SEQ  ID NO:15、 针对卡他莫拉菌的SEQ  ID NO: 18、 针对巨细胞病毒的SEQ  ID NO:21、 针对呼吸道合胞病毒的SEQ  ID NO:24、 针对乙型流感 病毒的SEQ  ID NO:27、 针对鼻病毒的SEQ  ID NO:30。 2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂， 其 特征在于： 检测EB病毒、 流感嗜血杆菌、 肺炎支原体的特异性引物和探针在检测 中共同使 用； 检测肺炎链球菌、 卡他莫拉菌、 巨细胞病毒的特异性引物和探针在检测中共同使用， 检 测呼吸道合胞病毒、 鼻病毒、 乙型流感病毒的特异 性引物和探针在检测中共同使用， 以人呼 吸道上皮细胞核糖核酸酶P基因为内参。 3.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂， 其 特征在于： 人呼吸道上皮细胞核糖核酸酶P基因的特异性引物为SEQ  ID NO:10和SEQ  ID  NO:11， 探针为SEQ  ID NO:12。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990261 A 2用于检测呼吸道感 染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及一种检测9种呼吸道感染性疾病病原体的特异性 引物和探针， 本发明利用多重实时荧 光定量PCR技 术检测呼吸道感染性疾病 病原体。 背景技术 [0002]病原微生物入侵呼吸道进行繁殖而诱发疾病称为呼吸道感染 （Respiratory   Tract Infection， RTI） 。 呼吸道感染可引起普通感冒、 急性病毒性咽炎、 喉炎、 急性支气管 炎、 急性毛细支气管炎以及肺炎等临床症状； 同时， 呼吸道感染是主要致死性疾病。 世界范 围内， 急性下呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的首要原因， 远远高于腹泻和意外 窒息等 其他死因。 病毒、 细菌、 真菌、 支 原体、 衣原体等多种 病原微生物可引起呼吸道感染。 [0003]临床上多发的病毒有呼吸道合胞病毒 （Respiratory  syncytial  virus， RSV） 、 流 感病毒 （Influenza  virus， IFV） 、 鼻病毒(Human  rhinovirus， HRV)、 巨细胞病毒(Human   cytomegalovirus， HCMV)、 EB病毒 （Epstein ‑Barr virus， EB V） 等。 而细菌集中于肺炎链 球菌 （Streptococcus  pneumoni ae， SP） 、 流感嗜血杆菌 （Haemophilus  influenzae， HI） 、 卡他莫 拉菌 （Moraxella  catarrhalis， MC） 等。 此外肺 炎支原体 （Mycoplasma  pneumoniae， MP） 等同 样可引起呼吸道感染。 [0004]早期及时准确的诊断有助于临床正确合理用药， 帮助患者尽早恢复健康， 减少病 死率。 细菌、 病毒培养 分离法作为临床病原体检测方法之一， 其检出率低、 耗费时间长， 无法 满足大量临床样 本的检测需求； NGS测序技术主要应用于非典型病原体的检测， 当前存在成 本高、 耗时长、 容易污染等不 足； 基于抗原抗体反应原理的免疫 学方法交叉反应易出现假阳 性； 基因芯片技术及数字P CR技术为新兴分子生物学检测方法， 当面面临费用较高且容易污 染、 生产标准化等问题； 环介导等温扩增技术引物设计要求较高， 难以实现多种病原体高通 量检测； PCR结合Sanger测序技术虽然特异性高， 但 其检测较为耗时， 通量较低， 往往不适合 临床即时诊断。 [0005]实时荧光定量PCR （Real ‑time fluoroscopy  quantitative  PCR， qPCR） 技术首先 被美国ABI （Applied  Biosystems） 公司推上市场， 在此后的2 0多年迅速发展被广泛应用。 多 重荧光定量PCR技术在呼吸道感染性疾病病原体检方面具有特异性强、 灵敏度高、 操作简 单、 时间短、 成本低廉， 适 合人群大量样本 筛查等众多优势。 发明内容 [0006]本发明应用靶向病原体基因组保守区扩增和多重实时荧光定量PCR技术， 提供了 一种用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂， 其包括用于检测9种呼吸道 感染性疾病病原体的特异性引物和探针， 还包括多重qPCR检测其他常规检测试剂， 该方法 以人呼吸道上皮细胞核糖核酸酶P （RNP） 为内参， 通过该方法， 可实现对呼吸道样本的高通 量检测， 具有简便、 快速、 准确和经济等特点， 为呼吸道病原体临床早期诊断检测提供了新 途径。说　明　书 1/9 页 3 CN 114990261 A 3