(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210660164.1 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 迈基诺 （重庆） 基因科技有限责任公 司 地址 400026 重庆市江北区港城东环路6号 1幢1-2、 2-2、 3 -2、 4-2、 5 -2、 6-2 (72)发明人 伍建　姬晓雯　王海丽　 (74)专利代理 机构 北京星通盈泰知识产权代理 有限公司 1 1952 专利代理师 黄正奇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6827(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G16B 20/50(2019.01) (54)发明名称 用于检测染色体非整倍体及单基因突变的 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物学检测领域， 具体涉及 一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的 试剂盒及应用； 本方法包括制备待测孕妇血浆游 离DNA文库， 将待测孕妇血浆游离DNA文库与探针 组中的探针进行杂交， 得杂交产物， 从杂交产物 中收集靶序列， 获得测孕妇血浆游离DNA捕获文 库， 将测孕妇血浆游离DNA捕获文库进行测序， 判 断待测孕妇及待测胎儿是否携带单基因遗传病 涉及的突变基因， 从待测孕妇血浆游离DNA文库 中的数据中提取非目标区域的数据， 计算判断胎 儿的第13号染色体、 第18号染色体、 第21号染色 体、 X染色体或Y染色体数目是增加、 减少或正 常； 本发明经过杂交捕获及高通量测序实现染色体 缺失或增加及50个显性基因的自发突变的一体 化检测。 权利要求书5页 说明书19页 CN 114990207 A 2022.09.02 CN 114990207 A 1.一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 包括探针组； 所 述探针组包括特异性探针； 每个特异性探针包括DNA片段1； 所述DNA片段1为单基因遗传病 对应的突变 基因的一部分； 所述探针组的设计方法包括： 获取单基因遗传病涉及的突变基因的外显子序列， 并前 后延伸50bp， 延伸后不足50bp的扩展至50bp， 提取每个区域的参考序列， 去掉重复区域的序 列， 从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针， 再一次往后移动n个碱基， 截取78bp的序列 做探针， 直到最后一个78bp； 所述单基因遗传病涉及的突变基因包括： COL1A1基因、 HRAS基因、 MECP2基因、 SMC1A基 因、 MAP2K2基因、 STAT3基因、 KCNQ2基因、 SPTB基因、 RIT1基因、 NIPBL基因、 HDAC8基因、 STXBP1基因、 ATP1A3基因、 TSC2基因、 KRAS基因、 FGFR2基因、 CBL基因、 COL2A 1基因、 RAD2 1基 因、 COL4A5基因、 ELANE基因、 NF1基因、 CHD7基因、 PHEX基因、 BRAF基因、 COL1A2基因、 PKD1基 因、 KIF11基因、 SOS2基因、 ANK1基因、 MAP2K1基因、 PRRT2基因、 SYNGAP1基因、 SMC3基因、 FGFR3基因、 SCN1A基因、 NSD1基因、 TSC1基因、 RB1基因、 SHOC2基因、 CDKL5基因、 SOS1基因、 PTPN11基因、 JAG1基因、 NRAS基因、 WT1基因、 RAF1基因、 FBN1基因、 PCDH19基因和SCN2 A基因。 2.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述探针组中的每 个特异性探针从5 ’末端到3’末端由引物1、 所述DNA片段1和引物 2组成； 所述引物1的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述引物 2的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述引物1和/或所述引物 2具有生物素 标记。 3.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括引物3、 引物4、 引物5和引物6中的至少一种； 所述引物3的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述引物4的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述引物5的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 所述引物6的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 4.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括接头序列组； 所述接头序列组中的序列1的5 ’ ‑3’端依次为 通用片段1、 随机序列和防污标签序列； 所述接头序列组中的序列2的5 ’ ‑3’端依次为防污标签序列和通用片段2； 所述接头序列组中的序列1的防污标签序列的3 ’端的最后一个碱基与序列1的通用片 段1的5’端第一个碱基互补； 所述随机序列为14个碱基的随机序列； 所述防污标签序列为13 ‑14个碱基的随机序列； 所述通用片段1的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示； 所述通用片段2的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示。 5.根据权利要求4所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述接头序列组为以下接 头序列组中的一组或多组； 接头1‑1 CTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNGCAGATCAGCGTA*T 接头1‑2 P‑TACGCTGATCTGCAGATCG GAAGAGCACACGTCTGA A 接头2‑1 CTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNATGTCTCACACGAG*T权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 114990207 A 2接头2‑2 P‑CTCGTGTGAGACATAGATCG GAAGAGCACACGTCTGA A 接头3‑1 CTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCTAGTCTAGCGTC *T 接头3‑2 P‑GACGCTAGACTAGAGATCG GAAGAGCACACGTCTGA A 接头4‑1 CTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCGTGAGATGTAGCA*T 接头4‑2 P‑TGCTACATCTCACGAGATCG GAAGAGCACACGTCTGA A 接头5‑1 CTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCATACTGAGTGCA*T 接头5‑2 P‑TGCACTCAGTATGAGATCG GAAGAGCACACGTCTGA A ； 所述接头序列组中的N为A、 T、 C、 G中的任一一个， 所述P表示磷酸化修饰； 所述*T表示碱 基T进行硫代修饰。 6.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括记载有判断标准甲和乙和/或丙的载体； 所述判断标准甲用于判断待测胎儿是否有5 0种遗传病单基因突变； 所述判断标准甲如下： 获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、 突变频率和测序深 度， 若待测孕妇SNP  Indel含有1138个致病突变位点中的任何一个点突变， 则待测胎儿携带 该突变位 点； 所述获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因 的突变位点的类型、 突变频率和测 序深度； 步骤如下： (1)制备待测孕妇血浆游离DNA文库； 制备待测孕妇血浆游离DNA文库的接头为权利要 求4或5中所述接 头组； (2)完成步骤(1)后， 将所述待测孕妇血浆游离DNA文库与权利要求1至3中任一探针组 进行杂交， 得到杂交产物； (3)完成步骤(2)后， 从所述杂交产物中收集靶序列， 获得靶序列捕获文库； (4)将步骤(3)得到的靶序列捕获文库进行高通 量测序， 得到测序原 始数据； (5)将步骤(4)得到的测序原始数据切除接头序列、 低质量碱基， 过滤， 然后比对到参考 基因组hg19的相应位置； (6)完成步骤(5)后， 去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列， 得到待测孕妇的数据； 然 后分析， 得到SNP和I NDEL的相关信息； (7)对步骤(6)得到的信息进行注释， 然后筛 选， 得到待测孕妇的SNP  Indel； (8)对HGMD数据库报道的位点进行注释， 然后 筛选获得1138个致病突变位点； 如果待测 孕妇的SNP  Indel含有1138致病突变位点中的任何一个点突变， 则待测胎儿携带相应突变 基因的突变位点； 否则待测胎 儿不携带相 应基因突变位点； 根据待测孕妇携带 的突变基因 的突变位点， 绘制目标基因缺失和重复分析图， 获得待测胎 儿关于所述单基因遗传病 涉及 的突变基因的突变位 点的类型、 突变频率和 测序深度； 所述判断标准乙如下： 所述判断标准乙即判断待测胎儿的目标常染色体数目是增加、 减少还是正常； 所述目 标常染色体为13号染色体、 18号染色体或21号染色体； 所述判断标准乙可如下： 从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 114990207 A 3