(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210578235.3 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 三亚中国检科院生物安全中心 地址 572025 海南省三 亚市崖州区科技城 标准厂房二期三楼C268区 申请人 中国检验检疫科 学研究院 　 中国农业大 学 (72)发明人 田茜　方雪阳　赵文军　罗来鑫　 马云龙　孙羽佳　 (74)专利代理 机构 北京市中伦律师事务所 11410 专利代理师 信建 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 用于检测水稻白叶枯病菌的组合产品及试 剂盒 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而 言， 涉及一种用于检测水稻白叶枯病菌的组合产 品及试剂盒。 该组合产品包括上游引物、 下游引 物和探针， 可配合等温核酸扩增体系进行使用。 本发明所提供的组合产品及试剂盒用于检测 tale基因， 检测灵敏度和特异性均较高， 且检测 方便， 耗时较短。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 115029470 A 2022.09.09 CN 115029470 A 1.组合产品， 包 含： 上游引物： GTG GTTCTTCATGCATGCGATCTCA AAG； 下游引物： ATC CACGTCACATCATC CATCTGCGCATC； 以及 探针： AAGTCGGCGACCTCCTGGGCCAGAACGGGATCATTTGXTATGCGCA AGTTGT； 其中所述探针为基于重组酶聚合酶扩增技术的探针， 第35位碱基T标记发光基团， 第38 位X为脱碱基核苷 酸类似物， 第39 位碱基T标记淬灭基团， 3 ’端进行阻断剂修饰； 所述阻断剂 用于阻断探针的聚合酶延伸。 2.根据权利要求1所述的组合产品， 所述脱碱基核苷酸类似物为四氢呋喃。 3.根据权利要求1所述的组合产品， 所述阻断剂为间臂， 优选 C3间臂。 4.根据权利要求1所述的组合产品， 所述发光基团为FAM， 所述淬灭基团是BHQ。 5.试剂盒， 其包 含权利要求1～4任一项所述的组合产品。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其还包含核酸提取试剂、 等温核酸扩增所用试剂、 阳 性对照和阴性对照中的一种或多种。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的 重组酶、 单链DNA结合蛋白、 链置换DNA聚合酶、 辅助蛋白、 核酸外切酶III、 反转录酶、 ATP、 ATP再生体系所用试剂、 pH调节剂、 dNTP、 各种分子量分布的BSA和/或PEG、 DTT以及水中的一 种或多种； 其中所述辅助蛋白用于改变重组酶 ‑引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程， 使 反应向更有利于等温核酸扩增进行。 8.根据权利要求7 所述的试剂盒， 所述重组酶选自uvsX和/或RecA； 可选地， 所述单链DNA结合蛋白为gp32； 可选地， 所述链置换DNA聚合酶选自BSu  DNA聚合酶和/或Sau  DNA聚合酶； 可选地， 所述辅助蛋白选自uvsY； 可选地， 所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、 磷酸肌酸及其平衡离子、 肌酸激酶、 肌 激酶、 焦磷酸酶、 蔗糖以及蔗糖磷酸 化酶中的一种或多种。 9.根据权利要求6～8任一项所述的试剂 盒， 所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂 或混合的液体试剂。 10.权利要求1～4任一项所述的组合产品， 或权利要求5～9任一项所述的试剂盒在检 测水稻白叶枯病菌中的应用。 11.根据权利要求1所述的应用， 检测在恒温扩增的条件下进行， 温度为37℃～42℃， 反 应时间≥20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029470 A 2用于检测水稻白叶枯病菌的组合产品及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而言， 涉及一种用于检测水稻  白叶枯病菌 的组合产品及试剂盒。 背景技术 [0002]水稻白叶枯病菌是黄单胞属的革兰氏阴性细菌， 是引起水稻白叶枯病   (bacterial  blight)的病原菌， 该病害分布在44个国家和地区， 包括各大洲  的稻作区， 是 一种世界性病害(EPPO)。 水稻白叶枯病菌被列入我国的进  境植物检疫性有害生物， 快速准 确的检疫检测技 术能有效阻止其传播， 保  证稻谷安全生产。 [0003]目前对于水稻白叶枯病菌 的检测主要是传统的生物测定， 直接分离以  及分子检 测的多聚酶链式反应(PCR)方法实时荧光PCR(qRT ‑PCR)方法  和血清学方法， 例如国标中以 含铁细胞接受因子基因为靶基因的PCR方法，  同时检测水稻白叶枯和谷枯(GB/T  28078‑ 2011)基于lipA和rupH基因的  可以定量水稻不同部位中的总菌落数的qRT ‑PCR。 但PCR和 ELISA方法灵  敏度有限， 且耗时较长， qRT ‑PCR依赖昂贵的检测仪器并对环境中的抑制  因 素和污染较为敏感， 容 易有假阳性或假阴性。 [0004]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)技术是2006年提出的一种新型多酶恒  温核酸扩增 技术， 可以快速且便捷地进行核酸检测分析。 在25 ‑43℃的恒温  条件下， RPA技术能在5 ‑ 20min内实现特定核酸序列的扩增并观察到结  果。 本实验采用的是改进的RPA技术称为多 酶恒温核酸快速扩增技 术 (MIRA)， 具有更好的稳定性和相同时间更高的荧 光值。 发明内容 [0005]本发明的第一目的在于提供一种组合产品， 包 含： [0006]上游引物： GTG GTTCTTCATGCATGCGATCTCA AAG； [0007]下游引物： ATC CACGTCACATCATC CATCTGCGCATC； 以及 [0008]探针： AAGTCGGCGACCTCCTGGGCCAGAACGGGATCATTTGXTAT GCGCAAGTTGT； [0009]其中所述探针为基于重组酶聚合酶扩增技术的探针， 第35位碱基T标  记发光基 团， 第38位X为脱碱基核苷 酸类似物， 第39 位碱基T标记淬灭  基团， 3’端进行阻断剂修饰； 所 述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。 [0010]本发明的第二目的在于提供 试剂盒， 其包 含如上所述的组合产品。 [0011]本发明的第三目的在于提供如上所述的组合产品， 或如上所述的试剂  盒在检测 水稻白叶枯病菌中的应用。 [0012]黄单胞属的一类效应蛋白可以起到转录活化因子 的作用， 干扰寄主生  理生化途 径， 引起病害发生， 编 码该类效应蛋白的tale基因在不同种和致  病变种的黄单胞菌属中有 少部分保守序列， 但存在特异 性序列和基因数量  上的差异。 本发明所提供的组合产品及试 剂盒用于检测tale基因， 检测灵  敏度和特异性均较高， 且检测方便， 耗时较短。说　明　书 1/9 页 3 CN 115029470 A 3