(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210608817.1 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 中国农业科 学院特产研究所 地址 130112 吉林省长 春市净月经济开发 区聚业大街 4899号 (72)发明人 邢秀梅　董依萌　王天骄　刘华淼　 李洋　张然然　 (74)专利代理 机构 北京翔石知识产权代理事务 所(普通合伙) 11816 专利代理师 黄素云 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记、 鉴别 方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种用于鉴别梅花鹿四川亚种 的分子标记、 鉴别方法及应用。 针对现有技术尚 无可用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记及鉴 别方法， 本发 明对梅花鹿分子标记进行了深入研 究， 得到了可用于鉴别梅花鹿四川亚种的SNP分 子标记， 所述分子标记包括5个SNP标记位点。 该5 个SNP标记位于ATP6基因片段上， 具有特异性强、 稳定性好的特点。 本发明还提供1对可用于鉴别 梅花鹿四川亚种SNP标记引物， 并建立了准确可 靠的检测方法。 本发明弥补了本领域目前尚无鉴 别梅花鹿四川亚种的分子标记检测技术的不足， 实现了梅花鹿亚种的精准鉴别， 对梅花鹿资源的 保护和管理方面具有重要理论和应用价 值。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图1页 CN 114836545 A 2022.08.02 CN 114836545 A 1.用于鉴别梅花鹿 四川亚种的分子标记， 其特征是， 所述分子标记包括5个SNP标记位 点： 标记 梅花鹿mtDNA基因组 位点 碱基 S‑1 ATP6基因3 06bp片段 31 T/C S‑2 ATP6基因3 06bp片段 73 C/T S‑3 ATP6基因3 06bp片段 173 T/C S‑4 ATP6基因3 06bp片段 235 T/C S‑5 ATP6基因3 06bp片段 257 C/T 。 2.如权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记， 其特征是， 所述5个SNP位 点S‑1～S‑5在梅花鹿四川亚种中为T、 C、 T、 T、 C； 在非梅 花鹿四川亚种中分别为C、 T、 C、 C、 T。 3.如权利要求2所述的用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记， 其特征是， 所述非梅花鹿 四川亚种包括梅花鹿东北亚种、 梅花鹿华南亚种、 梅花鹿台湾亚种、 梅花鹿北海道亚种、 梅 花鹿本州亚种 、 梅花鹿指名亚种 、 梅花鹿屋久岛亚种。 4.一种用于鉴别梅花鹿四川亚种的引物， 其特征是， 所述引物对序列如SEQ  ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示。 5.如权利要求4所述的用于鉴别梅花鹿四川亚种的引物， 其特征是， 所述引物对用于扩 增梅花鹿ATP6基因3 06bp片段。 6.权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记或权利要求4所述的用于鉴 别梅花鹿四川亚种的引物在鉴别梅 花鹿四川亚种中的应用。 7.权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记或权利要求4所述的用于鉴 别梅花鹿四川亚种的引物在制备试剂盒或在检测方法中的应用， 其特征在于， 所述试剂盒 或检测方法的用途为 鉴别梅花鹿四川亚种。 8.一种鉴别梅花鹿四川亚种的方法， 其特征是， 所述方法是： 提取待测样本DNA， 用权利 要求4所述的引物进行PCR扩增； 对PCR产物进行测序， 根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测 样品是否为 梅花鹿四川亚种。 9.一种鉴别梅花鹿四川亚种的试剂 盒， 其特征是， 所述试剂 盒包括权利要求4所述的引 物对。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836545 A 2用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记、 鉴别方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及用于鉴别梅花鹿四川亚种的分子标记、 鉴别方法及应用， 属于分子生 物学技术领域。 背景技术 [0002]梅花鹿(Cervus  nippon)属于哺乳纲(Mammalia)、 偶蹄目(Artiodactyla)、 鹿科 (Cervidae)、 鹿属(Cervus)， 是东亚季风区标志性动物， 从乌苏里江到越南均有分布。 目前 比较公认的说法是将梅花鹿分为13个亚种， 日本现存6个亚种分别是北海道亚种(Cervus   nipponyesoensis)、 本州亚种(Cervus  nippon centralis)、 指名亚种(Cervus   nipponnippon)、 屋久岛亚种(Cervus  nippon yakushimae)、 马毛岛亚种  (Cervus  nipponmageshimae)和琉球亚种(Cervus  nipponkeramae)。 越南有1个亚种： 越南亚种 (Cervus  nippon pseudaxis)。 中国梅花鹿有6个亚种， 其中华北亚种  (Cervus   nipponmandarinn s)和山西亚种(C ervus nippon grassianus)均已灭绝。 东北亚种(C ervus  nippon hortulorum)分布于辽宁、 吉林、 黑龙江、 西伯利亚东南部、 乌苏里江流域和 朝鲜， 体 型较大， 腹部青灰色， 夏毛红棕色， 白斑大但稀少， 冬毛白斑不明显， 甚至无白斑。 华南亚种 (Cervus nipponkopschi)在安徽南部、 浙江西北部和江西东北部等都有分布， 体型小， 夏毛 红棕色， 白斑较大， 体侧白斑较稀疏， 腹部灰棕色， 冬毛深棕色， 白斑不明显。 四川亚种 (Cervus nippon sichuanicus)  在1964年才被发现并经鉴定成为一个新的梅花鹿亚种， 其 栖息地主要位于四川若尔盖铁布、 包座自然保护区， 体型大， 腹部白色， 夏毛深红棕色， 白斑 小而密， 冬毛白斑不明显。 台湾亚种(Cervus  nippontaiouanus)主要分布在中国台湾地区， 体型小， 夏毛黄棕色， 颈后颜色较深， 夏毛与冬毛均有明显较大白斑。 [0003]目前梅花鹿的亚种划分主要依据形态学差异和地理分布， 存在着遗传资源分类混 乱的难题。 基于线粒体全基因组的梅花鹿起源进化研究结果表明， 东北亚种内部存在极大 的遗传分化， 家养梅花鹿与其他梅花鹿亚种存在基因交流， 这或是自然因素或是人为因素， 野生梅花鹿中的四川亚种、 华南亚种和台湾亚种在系统进化分析中均聚为单独的分支， 这 表明线粒体基因组蛋白质编码基因不同亚种 特异SNP可作为鉴别四川亚种、 华南亚种和台 湾亚种的候选分子标记。 [0004]分子SNP标记具有准确性高、 变异丰富、 操作简单等优点， 且分子标记不受环境因 素影响， 能直接反应动物基因水平的差异， 因而被广泛应用于动物个 体鉴别和种源鉴定 。 [0005]目前本领域内尚未有用分子标记鉴定梅 花鹿四川亚种的相关报道。 发明内容 [0006]本发明的目的是， 针对上述现有技术的不足， 提供一种用于鉴别梅花鹿四川亚种 的分子标记及其引物和应用， 有助于解决当前精准 鉴别梅花鹿亚种面临的问题。 [0007]本发明人对梅花鹿不同亚种样品的mtDNA序列进行了深入研究， 获得了可以用于 精准鉴别梅花鹿四川亚种的SNP标记和鉴定方法， 实现了梅花鹿不同亚种的精 准鉴别工作，说　明　书 1/9 页 3 CN 114836545 A 3