(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210631381.8 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 中国农业科 学院蔬菜花 卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 王长林　薄凯亮　段颖　邱喜岩　 (74)专利代理 机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 1 1129 专利代理师 向群 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的 SSR分子标记E201及其引物、 试剂盒与方法 (57)摘要 本发明“一种用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1 号’杂交种的SSR引物及鉴定方法 ”， 属于生物技 术辅助育种领域。 用于PCR扩增分子标记的引物 对为E201 ‑F和E201‑R， E201‑F的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示， E201 ‑R的核苷酸序列如SEQ   ID No.4所示。 基于PCR扩增反应， 该SSR分子 标记 能够在短时间内快速完成中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’ 杂交种的纯度鉴定， 稳定性高， 方法简便快捷， 结 果准确， 解决了现有的中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂 交种品种鉴定存在的鉴定周期长、 鉴定不准确等 问题， 可应用于中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种种 子纯度的分子标记辅助育种筛 选。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 115109864 A 2022.09.27 CN 115109864 A 1.用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201， 其特征在于， 检测所述 SSR分子标记E201的上游引物E201 ‑F序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引物E201 ‑R序列如SEQ   ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述的用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201， 其特征在于， 所述SSR分子标记在中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的母本 ‘823’基因组中的特 征条带序列如SEQ  ID NO.1。 3.根据权利要求1或2所述的用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记 E201， 其特征在于， 所述SSR分子标记在中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的父本 ‘824’基因组中 的特征条带序列如SEQ  ID NO.2； 和/或， 所述SSR分子标记在中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种基因组的特征条带序列分别 如SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 4.一种检测用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201的引物， 其特征 在于， 其上游引物E201 ‑F序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引物E201 ‑R序列如SEQ  ID NO.4所 示。 5.一种分子鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的引物， 其特征在于， 包括： 一种检测用 于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201的引物； 所述引物的上游引物 E201‑F序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引物E201 ‑R序列如SEQ  ID NO.4所示。 6.用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的试剂盒， 其特征在于， 包括： 一种检测用于 鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201的引物； 所述引物的上游引物E201 ‑F 序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引物E201 ‑R序列如SEQ  ID NO.4所示。 7.根据权利要求6所述的用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的试剂盒， 其特征在 于， 还包括： PCR试剂和/或电泳试剂。 8.一种分子鉴定 中国南瓜‘中蔬砧1号 ’杂交种的方法， 其特征在于， 采用检测用于鉴定 中国南瓜‘中蔬砧1号 ’杂交种的S SR分子标记E201的引物对候选南瓜材 料进行PCR。 9.根据权利要求9所述的一种分子鉴定 中国南瓜‘中蔬砧1号 ’杂交种的方法， 其特征在 于， 所述PCR的体系包括： 0.75ng/ μl  DNA模板， 正向和反向引物各5ng/ μl， 0.5 μL/ μl  2×3G  Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)； 和/或， 所述PCR体系为： 7.5ng  DNA模板， 正向和反向引物各50ng， 5μL  2×3G Taq  Master Mix for PAGE(Red Dye)， 加双蒸水至10 μl； 和/或， 所述PCR的程序包括： 95℃预变性3分钟； 以95℃变性15秒， 55℃退火15秒， 72℃ 延伸30秒为1个 循环， 共3 5个循环； 72℃保温5分钟； 和/或， 所述DNA模板指候选南瓜材 料的DNA。 10.根据权利要求8 或9所述的一种分子鉴定 中国南瓜‘中蔬砧1号 ’杂交种的方法， 其特 征在于， 根据所述PCR的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果； 电泳结果显示2条特征条带或测序结果同时测出如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的 2条序列的候选南瓜材 料为中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种； 和/或， 所述电泳指， 将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离； 和/或， 电泳条件为15 0V恒功率电泳分离1h 30min， 电泳后银染显色。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109864 A 2用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的S SR分子标记E201及 其引物、 试剂盒与方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术辅助育种领域， 特别涉及用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂 交种的SSR分子标记E201及其引物、 试剂盒与方法。 背景技术 [0002]中国南瓜(Cucurbita  moschataD.)， 一年生蔓生草本植物， 其作为一种重要的蔬 菜作物， 在全球范围内广泛栽培种植。 由于杂种优势的存在， 杂交一代种在抗病、 抗逆和果 实品质等方面明显优于两亲本。 但在中国南瓜杂交制种 过程中， 授粉期间由于母本雄花摘 除不彻底或不及时， 导致花粉落到母本雌花柱头上产生自交种子， 从而 出现假杂种， 导致种 子遗传纯度下降， 给生产造成巨大的经济损失。 因此， 优良一代杂交种 纯度的快速、 准确鉴 定成为中国南瓜生产中最 为迫切解决的问题之一。 [0003]种子纯度鉴定常用的方法主要包括田间形态鉴定、 同工酶鉴定和分子标记鉴定 等。 田间形态鉴定成本较高， 周期较长， 且鉴定结果还会受到环境因素的影响； 同工酶鉴定 准确性高， 但由于其具有组织和 器官特异性， 应用常常受到限制。 分子标记技术能够从DNA 水平上揭示子代和亲本间微小的遗传差异， 不受生长季节、 环境条件和栽培措施的影响， 可 以极大的缩短鉴定时间， 其中SSR标记具有多态性高， 数量多， 稳定性好， 并且易于检测等优 点， 被广泛应用于纯度鉴定和分子标记辅助育种等工作中。 [0004]近年来， 中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’由于其生长势旺， 抗病抗逆性强， 根系强大等优点， 常被用做砧木， 用于提高黄瓜、 西瓜等葫芦科作物的抗逆性， 推广面积日益扩大， 种子需求 量随之增大。 为了防止人工制种过程中出现母本自交形成假杂种这一现象， 急需确定中国 南瓜‘中蔬砧1号 ’杂交种种子纯度鉴定方法， 为中国南瓜的纯度鉴定提供技 术支持。 发明内容 [0005]基于上述领域的空白， 本发明旨在提供一种用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交 种种子纯度的SSR分子标记； 提供一种用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种种子纯度的 PCR检测试剂盒； 将所述的SSR标记应用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种真实性或种子 纯度等方面， 使得无需等待南瓜单株成长至果实成熟期再观察形态特征， 在幼苗期即可提 取DNA， 根据扩增片段区分 真假杂种， 有效鉴定杂种纯度。 [0006]本发明的上述目的是通过以下技 术方案来实现的： [0007]用于鉴定中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的SSR分子标记E201， 其特征在于， 检测所 述SSR分子标记E201的上游引物E201 ‑F序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引 物E201‑R序列如 SEQ ID NO.4所示。 [0008]所述SSR分子标记在中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的母本 ‘823’基因组中的特征条 带序列如SEQ  ID NO.1。 [0009]所述SSR分子标记在中国南瓜 ‘中蔬砧1号 ’杂交种的父本 ‘824’基因组中的特征条说　明　书 1/6 页 3 CN 115109864 A 3