(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607209.9 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 湖南大学 地址 410082 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路麓山门 (72)发明人 何凤姣　马景霞　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 专利代理师 刘晓静 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/37(2006.01) (54)发明名称 用于鉴定变形杆菌属的16SrRNA 基因特异性 序列片段及其筛 选方法 (57)摘要 本发明提供了变形杆菌属的16SrRNA 基因特 异性靶标序列片段及其筛选方法， 涉及基因筛选 技术领域， 所述特异性序列片段的核苷酸序列为 SEQIDNO.21、 SEQIDNO.29或SEQIDNO.31所示序列 中的一种。 利用NCBIGeneBank数据库比对功能、 以属内普适性、 属间特异性和菌外特异性为指 标， 所提出的筛选方法， 筛出了三条对变形杆菌 属“属”的高特异性16SrRNA基因序列片段。 并通 过PCR、 电泳实验方法对这些片段序列进行了验 证。 实现了变形杆菌属细菌在水溶液、 尿样中的 检测， 检测过程无需经过额外的细菌培养和核酸 提纯， 临床体液样本中的背景物质不会影响检测 结果。 权利要求书1页 说明书14页 序列表8页 附图4页 CN 114752694 A 2022.07.15 CN 114752694 A 1.用于鉴定变形杆菌属细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段， 其特征在于， 所述特异 性序列片段的核苷酸序列为SEQ  ID NO.21、 SEQ  ID NO.29或SEQ  ID NO.31所示序列中的一 种。 2.一种鉴定细菌 “属”的细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段的筛选方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： (1)获取目标细菌所在属的所有菌株的16S  rRNA基因序列； (2)将(1)中获取的16S  rRNA基因序列进行比对， 在全部16S  rRNA基因序列中筛选碱基 共有率100％且序列长度＞10nt的基因序列， 作为第一次候选片段， 完成 “属内普适性 ”筛 选； 将第一次候选片段与 Gene Bank16SrRNA细菌数据库进行比对筛选高度相似序列， 据输 出结果， 选择只出现目标菌属菌株的序列片段 得到第二次候选片段； (3)获取目标细菌所在科除目标菌属之外的所有菌株的16S  rRNA基因序列； (4)将(1)和(3)中获取的16S  rRNA基因序列进行对比， 在全部16S  rRNA基因序列中筛 选得到(2)中所述第二次候选片段的位置， 进一步筛选第三次候选片段， 完成 “属内普适性 ” 筛选； 将第三次候选序列片段与NCBI  Blast中的16S  rRNA细菌数据库进行比对筛选高度相 似序列， 据输出 结果， 选择只出现目标菌属菌株的序列片段， 得到第四 次候选片段； (5)将(4)所得第四次候选片段在真菌18S  rRNA数据库和人类基因组数据库 中进行比 对， 选择只与目标菌的16S  rRNA基因序列结合的候选靶标片段， 作为第五次候选序列片段； (6)将(5)筛选得到的第五次候选序列片段进行PCR扩增 ‑电泳验证， 得到目标菌种的 16S rRNA基因特异性检测的靶标片段。 3.如权利要求2所述鉴定细菌 “属”的细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段的筛选方 法， 其特征在于， 步骤(2)中筛选高度相似序列的筛选条件为Percent  Identity100％并且 Query Coverage100％的基因序列。 4.如权利要求2所述鉴定细菌 “属”的细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段的筛选方 法， 其特征在于， 步骤(4)中在第二次候选片段中选择满足以下条件的的序列， 作为第三次 候选片段： 以第二次候选片段5 ’端为起点， 查找共有率25％以上的碱基， 以此碱基为起始点向3 ’ 端延伸15～30个碱基， 得碱基序列长度为16～31nt的序列片段； 再从中筛选碱基共有率25 ～75％的碱基≥5个且碱基共有率10 0％的碱基≤9的片段， 作为第三次候选片段。 5.如权利要求4所述鉴定细菌 “属”的细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段的筛选方 法， 其特征在于， 步骤(4)中筛选高度相似序列筛选条件为Percent  Identity100％且Query   Coverage100％的基因序列。 6.如权利要求2所述鉴定细菌 “属”的细菌的16S  rRNA基因特异性序列片段的筛选方 法， 其特征在于， 步骤(5)所述只与目标菌的16S  rRNA基因序列结合的候选靶标片段的选择 条件为参数Highly  similar sequences(meg ablast)比对输出 结果为“0”的序列片段。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752694 A 2用于鉴定变形杆菌属的16SrRNA基因特异性序列片段及其筛 选方法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因筛选技术领域， 尤其涉及用于鉴定变形杆菌属的16S  rRNA基因特 异性序列片段及其筛 选方法。 背景技术 [0002]细菌感染是世界范围内引起疾病和死亡的常见原因， 例如克雷伯菌属、 肠杆菌属、 沙雷菌属、 柠檬酸杆菌属 等可以引起人类各种感染， 导致败血症、 脑膜炎、 脓毒血症甚至死 亡。 因此， 对这些菌属进行分类、 检测和鉴定具有重要意义。 变形杆菌食物中毒是我国常见 的食物中毒之一， 变形杆菌也是仅次于大肠杆菌的第二大引起泌尿系统感染的病原菌。 变 形杆菌广泛分布于环境中， 属内共有5个种， 包括奇异变形杆菌、 普通变形杆菌、 彭氏变形杆 菌、 产黏变形杆菌和豪氏变形杆菌， 其中奇异变形杆菌、 普通变形杆菌和彭氏变形杆菌与尿 路感染(UTI)关系密切。 变形杆菌作为临床上常见的条件致病菌， 还可能与其他细菌一起引 起呼吸道感染、 败血症等。 因此， 快速、 灵敏、 特异性地检测变形杆菌对于维护公共卫生安 全、 食品安全具有重要意 义， 对于尿路感染引起的相关疾病的早期诊断也十分重要。 [0003]对变形杆菌进行快速检测， 首先要选取合适的靶标， 这是实现快速、 灵敏、 特异性 检测细菌的重要前提。 目前用于变形杆菌检测的靶标有鞭毛、 代谢产物、 蛋白质和核酸等。 利用鞭毛、 代谢产 物和蛋白质等来检测变形杆菌存在特异 性不够、 灵敏度不高、 需要 大型昂 贵设备和检测时间长、 操作繁琐等问题， 因此现在主要 是利用核酸来检测变形杆菌。 现有的 用来鉴定变形杆菌的核酸靶标有ureR基因、 tur基因、 atpD基因、 ureC基因、 tuf基因、 16Sr RNA基因、 16S ‑23Sr RNA基因间区等。 其中16S  rRNA基因在细菌内丰度高， 长度适中， 存在9 个可变区和9个保守区， 交叉排列。 许多研 究已经确 定了16S rRNA高变区序列， 这些序列可 以识别单个细菌物种或区分有限数量的不同菌种或菌属， 是细菌鉴定与分类的理想靶标。 因此， 我们认为可以通过筛选高特异性和高杂交效率的16S  rRNA寡核苷酸序列作为靶标， 实现已知或者未知细菌的快速、 灵敏的检出。 目前使用16S  rRNA基因作为靶标来检测变形 杆菌的报道并不多， 如现有文献中共找到三条序列， 见表1所示。 然而在这些文献中并未找 到明确和系统的筛选步骤， 且将这些序列导入  NCBI Blast中比对发现， 这些序列片段并不 具有特异性或普适 性， 它们不能作为变形 杆菌属的特异性检测靶标。 [0004]表1文献报道的变形 杆菌属的16S  rRNA基因特异序列片段 [0005] 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种用于鉴定变形杆菌属的16S  rRNA基因特异性序列片说　明　书 1/14 页 3 CN 114752694 A 3