(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210711630.4 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 江门市灿明生物科技有限公司 地址 529040 广东省江门市江海区创业路 13号 (72)发明人 廖端芳　齐捧　曾娅玲　罗晶晶　 肖莉　张佳　李凯　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 专利代理师 王秉丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 甲基化位点的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种甲基化位点的检测方法及 检测试剂盒， 检测方法： 提供待测DNA样本， 用甲 基化依赖性内切酶进行酶切； 将所得酶切产物与 接头片段连接， 制备扩增模板； 采用扩增引物对 扩增模板进行扩增， 收集扩增产物检测； 接头片 段为发夹 型接头或者双链接头， 接头片段为发夹 型接头， 扩增引物的数量为一条， 且扩增引物与 待测DNA样本上甲基化依赖性内切酶的酶切位点 的上游序列特异性结合， 接头片段为双链接头， 扩增引物包括甲基化位点特异性引物和接头引 物， 甲基化位点特异性引物的数量为一条或者多 条， 接头引物的数量为一条， 且双链接头的反链 包含接头引物对应的片段， 甲基化位点特异性引 物包含接头引物对应的片段。 避免了对待测DNA 样本的破坏。 权利要求书1页 说明书12页 序列表5页 附图7页 CN 115011677 A 2022.09.06 CN 115011677 A 1.一种甲基化 位点的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法包括如下步骤： 提供待测DNA样本， 用甲基化依赖性内切酶进行酶切， 制备酶切产物； 将所述酶切产物与接 头片段连接， 制备扩增模板； 采用扩增引物对所述扩增模板进行扩增， 收集扩增产物进行甲基化位点的定性或/和 定量检测； 其中， 所述接头片段为发夹型接 头或者双链接 头， 所述接头片段为发夹型接头， 所述扩增引物的数量为一条， 且所述扩增引物与所述待 测DNA样本上 所述甲基化依赖性内切酶的酶切位 点的上游序列特异性结合， 所述接头片段为双链接头， 所述扩增引物包括甲基化位点特异性引物和接头引物， 所 述甲基化位点特异性引物的数量为一条或者多条， 所述接头引物的数量为一条， 且所述双 链接头的反链包含所述接头引物对应的片段， 所述甲基化位点特异 性引物包含所述接头引 物对应的片段。 2.根据权利要求1所述的甲基化位点的检测方法， 其特征在于， 所述甲基化依赖性内切 酶选自FspE  I、 LpnP I和MspJ I中的一种或者多种。 3.根据权利要求1或者2所述的甲基化位点的检测方法， 其特征在于， 所述发夹型接头 选自SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:16或者SEQ  ID NO:22所示的单链接 头中的一种。 4.根据权利要求1或者2所述的甲基化位点的检测方法， 其特征在于， 所述双链接头选 自SEQ ID NO:7和SEQ  ID NO:8、 SEQ  ID NO:16和SEQ  ID NO:8， 或者SEQ  ID NO:22和SEQ  ID  NO:8所示的双链接 头中的一种。 5.根据权利 要求4所述的甲基化位点的检测方法， 其特征在于， 所述接头引物如SEQ  ID  NO:10所示。 6.一种甲基化位点的检测试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1至5任一项中定义的接 头片段， 还包含权利要求 1至5任一项中定义的甲基化依赖性内切酶和扩增引物中的一种或 者多种。 7.根据权利要求6所述的甲基化位点的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包 含DNA提取 试剂。 8.根据权利要求6或者7所述的甲基化位点的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包含扩增试剂。 9.根据权利要求6或者7所述的甲基化位点的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包含定性检测试剂。 10.根据权利要求6或者7所述的甲基化位点的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包含定量检测试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011677 A 2甲基化位点的检测方 法及检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物技术领域， 特别是涉及一种甲基化位点的检测方法及检测试 剂盒。 背景技术 [0002]近年表观遗传学的逐渐进步， 对甲基化检测的需求越来越高， 因此涌现出多种甲 基化检测 技术。 目前 甲基化分析技术中， 应用最为广泛的是以亚硫酸氢钠将非甲基化胞嘧 啶C转化为U的化学转化作为基础发展起来的多种PCR技术和测序技术。 但由于亚硫酸氢钠 对核酸具有破坏作用， 一方面使得待测核酸样本需要较大量的核酸起始量， 另一方面这种 甲基化测序还需要与常规测序进行比对。 因此， 基于亚硫酸氢钠的甲基化测序对于低丰度 甲基化分析和对于单一细胞的 甲基化测序都存在一定的局限性。 发明内容 [0003]基于此， 有必要提供一种核酸需求量少的甲基化位点的检测方法。 该检测方法避 免了对待测DNA样本的破坏， 待测DNA样本需求 量相应降低。 [0004]在本发明的第一方面， 提供一种甲基化位点的检测方法， 所述检测方法包括如下 步骤： [0005]提供待测DNA样本， 用甲基化依赖性内切酶进行酶切， 制备酶切产物； [0006]将所述酶切产物与接 头片段连接， 制备扩增模板； [0007]采用扩增引物对所述扩增模板进行扩增， 收集扩增产物进行甲基化位点的定性 或/和定量检测； [0008]其中， [0009]所述接头片段为发夹型接 头或者双链接 头， [0010]所述接头片段为发夹型接头， 所述扩增引 物的数量为一条， 且所述扩增引 物与所 述待测DNA样本上 所述甲基化依赖性内切酶的酶切位 点的上游序列特异性结合， [0011]所述接头片段为双链接头， 所述扩增引物包括甲基化位点特异性引物和接头引 物， 所述甲基化位点特异性引物的数量为一条或者多 条， 所述接头引物的数量为一条， 且所 述双链接头的反链包含所述接头引物对应的片段， 所述甲基化位点特异 性引物包含所述接 头引物对应的片段。 [0012]在本发明的一些实施例中， 所述甲基化依赖性内切酶选自Fsp EI、 LpnPI和MspJI中 的一种或者多种。 [0013]在本发明的一些实施例中， 所述发夹型接头选自S EQ ID NO:5、 SEQ ID NO:16或者 SEQ ID NO:22所示的单链接 头中的一种。 [0014]在本发明的一些实施例中， 所述双链接头选自SEQ  ID NO:7和SEQ  ID NO:8、 SEQ   ID NO:16和SEQ  ID NO:8， 或者SEQ  ID NO:22和SEQ ID NO:8所示的双链接 头中的一种。 [0015]在本发明的一些实施例中， 所述接 头引物如SEQ  ID NO:10所示。说　明　书 1/12 页 3 CN 115011677 A 3