(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610543.X (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 深圳联合医学 科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市南 山区西丽 街 道留仙洞村留仙文化园第6栋2楼202 室 (72)发明人 雷湘华　郭永超　王艳平　苏莹　 叶苑青　徐仲尧　 (74)专利代理 机构 深圳舍穆专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 44398 专利代理师 黄贤炬 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 目标基因的检测方法、 引物组、 试剂盒及应 用 (57)摘要 本公开描述了一种目标基因的检测方法， 包 括以下步骤： 针对一个或多个目标基因， 从每个 目标基因的基因序列中选取多个目标区域， 针对 每个目标区域分别设计引物组； 准备多个待测核 酸样本； 使用引物组对各个待测核酸样本进行 PCR扩增， 得到目标文库； 对目标文库进行测序， 获取目标文库的测序数据； 基于测序数据判断各 个目标区域是否被检出； 并且对于各个待测核酸 样本， 若被检出的目标区域的数量与多个目标区 域的数量相比大于预设比例， 则判定待测核酸样 本中含有目标基因。 根据本公开的检测方法， 能 够提高检测结果准确性。 本公开还描述了一种用 于检测目标基因的引物组、 试剂盒及应用。 权利要求书2页 说明书23页 序列表6页 附图5页 CN 114807334 A 2022.07.29 CN 114807334 A 1.一种目标基因的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 针对一个或多个目标基因， 从每个目标基因的基因序列中选取多个目标区域， 针对每 个目标区域分别设计引物组， 以得到针对所述多个目标区域的多个引物组， 各个引物组分 别包括第一正向引物、 第一反向引物、 第二反向引物、 第二正向引物和第三反向引物， 所述 第一正向引物包括第一测序引物和与所述目标区域5 ’端相匹配的序列， 所述第一反向引物 包括第二测序引物和与所述目标区域3 ’端相匹配的序列， 所述第二反向引物包括所述第二 测序引物、 第一条形码和第一测序接头， 所述第二正向引物包括第二测序接头和所述第一 测序引物， 所述第三反向引物包括所述第一测序接 头； 准备多个待测核酸样本； 使用所述第 一正向引物、 所述第 一反向引物和所述第 二反向引物分别对各个待测核酸 样本进行PCR扩增， 得到各个待测核酸样本的扩增产物； 将所述各个待测核酸样本的扩增产物混合得到混合扩增产物， 并使用所述第 二正向引 物和所述第三反向引物对所述混合扩增产物进行PCR扩增， 得到目标文库； 对所述目标文库进行测序， 获取所述目标文库的测序数据， 所述测序数据包括所述目 标文库的序列， 所述目标文库的序列包括所述第一条 形码的序列； 基于所述目标文库的序列判断各个目标区域是否被检出， 并基于所述第 一条形码的序 列识别各个待测核酸样本； 并且 对于各个待测核酸样本， 若所述一个或多个目标基因中的任一个目标基因中被检出的 所述目标区域的数量与所述多个目标区域的数量的比值大于预设比例， 则判定所述待测核 酸样本中含有该目标基因。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 对于各个待测核酸样本， 若所述一个 或多个目标基因中的任一个目标基因中被检出的所述目标区域的数量与所述多个目标区 域的数量的比值 不大于所述预设比例， 则判定所述待测核酸样本中不含该目标基因。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述第 一正向引物从5 ’端到3’端依次 为所述第一测序引物和与所述目标区域5 ’端相匹配的序列， 所述第一反向引物从5 ’端到3’ 端依次为所述第二测序引物和与所述目标区域3 ’端相匹配的序列， 所述第二反向引物从5 ’ 端到3’端依次为所述第一测序接头、 所述第一条形码和所述第二测序引物， 所述第二正向 引物从5’端到3’端依次为所述第二测序接头和所述第一测序引物， 所述第三反向引物 为所 述第一测序接 头。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 将所述混合扩增产物作为特定批次的 扩增产物， 所述第二正向引物还包括第二条形码， 所述 目标文库的序列还包括所述第二条 形码的序列， 并基于所述第二条 形码的序列识别所述特定 批次。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述第 二正向引物从5 ’端到3’端依次 为所述第二测序接 头、 所述第二条 形码和所述第一测序引物。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述第 一测序引物和所述第 二测序引 物为illumina测序平台的测序引物， 所述第一测序接头为illumina测序平台的P7接头， 所 述第二测序接 头为illumina测序平台的P5 接头。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 从所述目标基因的基因序列中选取3 个目标区域， 并针对各个目标区域分别设计引物组， 得到 3个引物组。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807334 A 28.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述目标基因的基因序列中的各个目 标区域彼此之间不重 叠或仅部分重 叠。 9.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 基于所述目标基因 的阳性质控 品与阴 性质控品获取所述多个目标区域中的各个目标区域的检出阈值， 并基于所述检出阈值判断 各个目标区域是否被 检出。 10.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述待测核酸样本包括DNA样本和 RNA样本中的至少一种， 并且若所述待测核酸样本包括RNA样本， 则在获取所述待测核酸样 本之后， 还 包括对所述待测核酸样本进行反转录的步骤。 11.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述预设比例为5 0%至80%。 12.一种用于检测目标基因的引物组， 是用于对待测核酸样本进行检测的引物组， 其特 征在于， 是从所述目标基因的基因序列中选取多个目标区域并针对各个目标区域分别设计 的引物组， 所述引物组分别包括第一正向引物、 第一反向引物、 第二反向引物、 第二正向引 物和第三反向引物， 所述第一正向引物包括第一测序引物和与所述目标区域5 ’端相匹配的 序列， 所述第一反向引物包括第二测序引物和与所述 目标区域3 ’端相匹配的序列， 所述第 二反向引物包括所述第二测序引物、 第一条形码和第一测序接头， 所述第二正向引物包括 第二测序接头、 第二条形码和所述第一测序引物， 所述第三反向引物包括所述第一测序接 头； 其中， 使用所述第一正向引物、 所述第一反向引物和所述第二反向引物对所述待测核酸 样本进行PCR扩增并得到扩增产物， 再使用所述第二正向引物和所述第三反向引物对所述 扩增产物进行PCR扩增。 13.一种用于检测目标基因的试剂盒， 其特 征在于， 包括如权利要求12所述的引物组。 14.根据权利要求13所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括阳性质控品、 阴性质控 品、 以及 具有PCR缓冲液和DNA聚合酶的建库试剂。 15.一种引物组在制备检测目标基因的试剂 盒中的应用， 其特征在于， 所述引物组为如 权利要求12所述的引物组。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807334 A 3