(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210581772.3 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区友爱北路51号 (72)发明人 谢芝勋　任红玉　王盛　万丽军　 谢丽基　谢志勤　邓显文　范晴　 罗思思　张艳芳　黄娇玲　曾婷婷　 张民秀　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 董函竹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检 测方法 (57)摘要 本发明公开了禽呼肠孤病毒分子信标LAMP 检测试剂及检测方法。 具体地公开了用于检测禽 呼肠孤病毒的引物组合物， 所述引物组合物可由 引物ARV‑S1‑F3、 引物ARV ‑S1‑B3、 引物ARV ‑S1‑ FIP、 引物ARV ‑S1‑BIP、 引物ARV ‑S1‑FLOOP和引物 ARV‑S1‑BLOOP组成， 还公开了用于检测禽呼肠孤 病毒的组合物， 所述组合物包括所述引物组合物 和探针ARV ‑S1‑MB。 本发明分子信标LAMP检测试 剂及检测方法因分子信标的引入大大提高了检 测的特异性， 可有效避免气溶胶污染， 真正做到 了简便、 快速、 准确； 该方法可应用于基层检测， 及时对发病个体以及隐性 感染个体进行诊断， 为 ARV防控提供有效支持。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115198032 A 2022.10.18 CN 115198032 A 1.用于检测禽呼肠孤病毒的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物由引物ARV ‑S1‑ F3、 引物ARV ‑S1‑B3、 引物A RV‑S1‑FIP、 引物ARV ‑S1‑BIP、 引物A RV‑S1‑FLOOP和引物A RV‑S1‑ BLOOP组成， 所述引物ARV ‑S1‑F3为核苷酸序列是SEQ  ID No.1的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑ B3为核苷酸序列是SEQ  ID No.2的单链DNA； 所述引 物ARV‑S1‑FIP为核苷酸序列是SEQ  ID  No.3的单链DNA； 所述引 物ARV‑S1‑BIP为核苷酸序列是SEQ  ID No.4的单链DNA； 所述引 物 ARV‑S1‑FLOOP为核苷酸序列是SEQ  ID No.5的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑BLOOP为核苷酸序 列是SEQ ID No.6的单链DNA。 2.用于检测禽呼肠孤病 毒的组合物， 其特征在于， 所述组合物包括权利要求1所述的引 物组合物和探针ARV ‑S1‑MB， 所述探针ARV ‑S1‑MB的核苷酸序列如SEQ  ID No.7所示。 3.根据权利要求2所述的组合物， 其特征在于， 所述探针ARV ‑S1‑MB的5’端标记荧光基 团， 3’端标记淬灭基团。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针ARV ‑S1‑MB的5’端标记CY5， 3 ’ 端标记BHQ ‑3。 5.权利要求1所述的引物组合物或权利要求2 ‑4中任一所述的组合物的下述任一种应 用： A1)在检测禽呼肠孤病毒或制备用于检测禽呼肠孤病毒的产品中的应用； A2)在制备诊断或辅助诊断禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用； A3)在制备筛查或辅助筛查 禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用； A4)在禽呼肠孤病毒防控中的应用。 6.用于检测禽呼肠孤病毒的试剂或试剂盒， 其特征在于， 所述试剂或试剂盒包含权利 要求1所述的引物组合物。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中所述引物A RV‑S1‑F3、 引物 ARV‑S1‑B3、 引物A RV‑S1‑FIP、 引物ARV ‑S1‑BIP、 引物ARV ‑S1‑FLOOP和引物ARV ‑S1‑BLOOP的 摩尔比为1:1: 8:8:4:4。 8.根据权利要求6或7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括权利要求2 ‑4中任 一所述的探针ARV ‑S1‑MB。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中所述探针ARV ‑S1‑MB的使 用浓度为0.04 μM 。 10.一种检测禽呼肠孤病毒的方法， 其特征在于， 所述方法包括利用权利要求1所述的 引物组合物， 或权利要求2 ‑4中任一所述的组合物， 或权利要求6 ‑9中任一所述的试剂盒对 待测样品进行检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115198032 A 2禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及禽呼肠孤病毒 分子信标LAMP检测试剂及 检测 方法。 背景技术 [0002]禽呼肠孤病毒(Avian  reovirus， ARV)是一类重要的禽类致病病原体， 已在我国各 地广泛流行， 并呈现逐渐扩 大的趋势。 ARV主要感染鸡、 火鸡以及 野鸟等， 可引起病毒性关节 炎、 慢性呼吸道疾病和矮小综合征等， 还可引起机体免疫系统的损伤， 引发多种病原体的混 合感染， 最 终导致鸡群报酬率降低， 死亡率升高， 造成严重的经济损失。 ARV对环 境的耐受性 较强， 且传播方式较为复杂， 主要以粪 ‑口途径和呼吸道感染进行传播， 也可通过鸡蛋的垂 直传播和破损皮肤 感染等途径进 行传播， ARV的这些特性为疾病防控 带来很大困难， 为了进 行有效的ARV防控， 亟需建立 一种简便、 快速、 准确的诊断方法。 [0003]目前针对ARV的检测方法有： 实时荧光定量PCR、 RT ‑PCR、 荧光抗体试验、 ELISA等， 但以上检测方法均存在试验周期长、 操作繁琐、 特异性不强、 试验器材昂贵等缺点。 环介导 等温扩增技术(loop ‑me‑diated isothermal  amplification， LAMP)是Notomi等人发明的 一种恒温条件下 的核酸扩增技术， 该方法具有操作简单、 特异性强、 结果可视化等优势， 在 疾病检测中具有广泛的应用前景。 分子信标是一种灵敏度高、 特异 性好、 具有茎环结构的双 标记核酸探针， 其通过与靶标特异性结合而使空间构象发生改变， 从而呈现相 应的荧光信 号， 已被广泛用于DNA/RNA的定量分析、 病原体检测以及 活动成像等领域。 分子信标相较于 传统的荧光染料具有更强的特异性， 将分子信标引入LAMP反应体系， 整个试验流程无需开 盖， 可有效避免气溶胶污染， 真正做到了简便、 快速、 准确， ARV分子信 标LAMP检测方法的建 立对ARV的快速诊断及有效防控具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题是如何简便、 快速、 准确和/或可视化地检测禽呼肠孤 病毒， 所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题， 本领域技术人员通过以下描述可以 清楚地理解本文未提及的其它技 术主题。 [0005]为解决上述技术问题， 本发明首先提供了用于检测禽呼肠孤病毒(Avian   reovirus， ARV)的引物 组合物， 所述引物组合物可由引物ARV ‑S1‑F3、 引物ARV ‑S1‑B3、 引物 ARV‑S1‑FIP、 引物ARV ‑S1‑BIP、 引物ARV ‑S1‑FLOOP和引物ARV ‑S1‑BLOOP组成， 所述引物ARV ‑ S1‑F3可为核苷酸序列是SEQ  ID No.1的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑B3可为核苷酸序列是 SEQ ID No.2的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑FIP可为核苷酸序列是SEQ  ID No.3的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑BIP可为核苷酸序列是SEQ  ID No.4的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑FLOOP可 为核苷酸序列是SEQ  ID No.5的单链DNA； 所述引物ARV ‑S1‑BLOOP可为核苷酸序列是SEQ  ID  No.6的单链DNA。 [0006]所述引物组合物是基于LAMP设计的引物组合物， 其中所述引物ARV ‑S1‑F3和引物说　明　书 1/6 页 3 CN 115198032 A 3