(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210627371.7 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 中棉所长江科研中心 地址 246200 安徽省安庆市望江县华阳镇 华莲公路南侧 申请人 江苏省农业科 学院 (72)发明人 吴磊　周克海　张旭　马雄风　 何漪　闫东良　姜朋　杨蕊　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 转基因小麦外源插入片段的旁侧序列及检 测方法 (57)摘要 本发明涉及农业生物 技术领域， 特别的涉及 一种转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003的外源插入 片段NOS端的旁侧序列及其应用。 本发明通过采 用如SEQ ID NO.1~5所示的引物和探针， 构建了 PCR检测方法对转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003 的外源插入片段NOS端的旁侧序列进行定性和定 量检测， 可以对小麦样品是否含有所述转基因转 化事件进行有效筛选， 加速对优异转化体的选 择， 并适用于小麦OExat ‑003中转基因转化事件 的检测和追溯。 权利要求书2页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 114836438 A 2022.08.02 CN 114836438 A 1.一种转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003外源插入片段NOS端的旁侧序列， 其特征在于： 所述旁侧序列如SEQ  ID NO.11所示， 所述序列的第1至2191碱基为外源 载体序列； 第2192至 2222碱基为填充序列； 第2223至2635碱基为小麦基因组序列； 第1至2635碱基共同组成转基 因抗赤霉病小麦OExat ‑003外源插入片段NOS端的旁侧序列。 2.根据权利要求1所述的旁侧序列在小麦转基因检测中的应用， 其特征在于， 在转基因 小麦OExat ‑003中定性或定量检测所述旁侧序列， 以判断小麦中是否含有特异性转基因转 化事件。 3.根据权利要求2所述 的应用， 其特征在于， 采用SEQ  ID NO.1， SEQ  ID NO.2所示的引 物对旁侧序列进行定性检测； 采用SEQ  ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ  ID NO.5所 示探针对旁侧序列进行定量检测。 4.一种转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003外源插入片段NOS端的旁侧序列的检测方法， 其 特征在于， 所述方法包括如下步骤： S11、 获得小麦样品中的小麦全基因 组DNA； S12、 以SEQ  ID NO.1， SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增， 获得扩增产物； S13、 检测扩增产物， 根据扩增产物判断小麦样品中是否存在特异性 转基因转 化事件。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S12中PCR扩增的扩增体系为： 10 ×buffer 1µl， 浓度为25 mM的MgCl2 0.5  µl, 浓度为2.5 mM的dNTP0.5   µl， 浓度为10 µM的引 物SEQ ID NO.1 0.5  µl， 浓度为10µM的引物SEQ  ID NO.2 0.5  µl， 浓度为5U/ µl的Taq聚合 酶 0.2  µl， 模板 DNA 10‑100 ng， ddH2O补足至10   µl； PCR扩增程序为： 94 ˚C 3分钟； 94˚C10 秒， 57˚C 30秒， 72˚C 20秒， 30个循环； 72˚C延伸5分钟。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S13中检测扩增产物为电泳检测， 将扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳后获得检测结果， 若扩增产物中同时含有大小为 336bp的条带， 则判定小麦样品中含有转基因小麦OExat ‑003的特异性转基因转化事件； 否 则， 判定为 不含有转基因小麦OExat ‑003的特异性 转基因转 化事件。 7.一种转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003外源插入片段NOS端的旁侧序列的检测方法， 其 特征在于， 所述方法包括如下步骤： S21、 获得小麦样品中的小麦全基因 组DNA； S22、 以SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.4所示的引物和SEQ  ID NO.5所示探针对进行PCR扩 增， 获得扩增产物； S23、 检测扩增产物， 根据扩增产物判断小麦样品是否含有特异性 转基因转 化事件。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S22中PCR扩增的扩增体系为2 × SGExcel GoldStar  TaqMan Mixture 10µl， 浓度为10 µM的引物SEQ  ID NO.3 0.4  µl， 浓度 为10µM的引物SEQ  ID NO.4 0.4  µl， 浓度为10µM的Taqman探针引物SEQ  ID NO.5 0.4  µl， 模板 DNA 0.01‑100 ng， ddH2O补足至20   µl； PCR扩增程序： 95 ˚C 预变性10分钟； 95 ˚C变性 15秒， 60˚C 退火/延伸1分钟， 3 0个循环。 9.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S23中所述判断的标准为： 若出现 正常的荧光扩增曲线， 且Ct 值小于35， 则判定小麦样品中含有转基因小麦OExat ‑003的特异 性转基因转 化事件； 否则， 判定为 不含有转基因小麦OExat ‑003的特异性 转基因转 化事件。 10.一种转基因抗赤霉病小麦OExat ‑003外源插入片段NOS端的旁侧序列的试剂或试剂权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836438 A 2盒， 其特征在于， 所述试剂或试剂盒包括SEQ  ID NO.1， SEQ  ID NO.2所示的引物， 或所述试 剂或试剂盒包括SEQ  ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ  ID NO.5所示探针。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836438 A 3