(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210768659.6 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 宜宾五粮液股份有限公司 地址 644007 四川省宜宾市岷江西路15 0号 申请人 重庆大学 (72)发明人 罗阳　郑佳　陈恒屹　陈晓辉　 彭志云　陈艺　 (74)专利代理 机构 成都虹桥专利事务所(普通 合伙) 51124 专利代理师 许泽伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 酿酒酵母的特异 性探针、 定量检测方法及应 用 (57)摘要 本发明属于白酒酿造技术领域， 具体涉及酿 酒酵母的特异性探针、 定量检测方法及应用。 本 发明所解决的技术问题是提供快速、 准确的识别 酿酒酵母的特异性探针、 定量检测方法及应用。 本发明的方法， 包括如下步骤： 将待测样品与杂 交链式反应探针缓冲液混合后充分反应， 然后加 入底物发夹探针反应， 再加入氯化血红素、 ABTS 以及过氧化氢混合反应， 根据混合溶液最终颜色 定量待测样品中的酿酒酵母。 本发 明通过设计探 针检测体系， 实现了酿酒酵母的26s  rDNA的识 别， 信号放大 以及最终的比色检测， 通过构建巧 妙而精简的等温扩增体系， 实现了酿酒酵母26s   rDNA的超灵敏， 高特异性和简单便携的比色检 测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115044701 A 2022.09.13 CN 115044701 A 1.酿酒酵母的特异性探针， 其特征在于： 包括杂交链式反应探针H1、 H2和底物发夹探 针； 其中， 杂交链式反应探针H1、 H2核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示； 底 物发夹探针核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 2.酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 将待测样品与杂交链式 反应探针缓冲液混合后充分反应， 然后加入底物发夹探针反应， 再加入氯化血 红素、 ABTS以 及过氧化氢混合反应， 根据混合溶 液最终颜色定量待测样品中的酿酒酵母。 3.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 待测样品是提取的 酿酒酵母DNA 原液稀释到 0.1～100nM DNA浓度的酿酒酵母DNA提取 液。 4.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 所述反应缓冲 液包 括： 10mM Tris‑HCl， 0.5mM MnCl2， 50nM KCl， 100nM NaCl， pH＝7.4。 5.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 所述杂交链式反应 探针的核苷酸序列为H1和H2， H1的序列如SEQ  ID NO： 1所示， H2的序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述底物发夹探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 6.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 待测样品与杂交链 式反应探针混合后反应温度为20～37℃， 反应时间为1～3 h。 7.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 杂交链式反应探针 H1， H2与底物发夹探针的物质的量比例为1:1:2～10； 优选地， 杂交链式反应探针H1， H2与底 物发夹探针的物质的量比例为1:1:2、 1:1:4、 1:1: 8或1:1:10 。 8.根据权利要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 底物发夹探针反应 温度为20～37℃， 反应时间为0.5～1h 。 9.根据权利 要求2所述酿酒酵母比色定量检测的方法， 其特征在于： 氯化血红素， ABTS， 过氧化氢的物质的量的比例为1:4000～ 5000:10000～80000； 优选地， 氯化血红素， ABTS， 过 氧化氢的物质的量的比例为1:5 000:10000， 1:4000:80000或1:4000:10000。 10.权利要求1所述酿酒酵母的特异性探针或权利要求1～9任意一项所述酿酒酵母比 色定量检测的方法在白酒固态发酵工业中或其 他食品加工行业中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044701 A 2酿酒酵母的特异性探针、 定量 检测方法及应用 技术领域 [0001]本发明属于白酒酿造技术领域， 具体涉及酿酒酵母的特异性探针、 定量检测方法 及应用。 背景技术 [0002]酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)， 又称面包酵母或者出芽酵母， 是与人类 关系最广泛的一种酵母， 用于酿 酒及制作面包和馒头等食品。 它的细胞为球形或者卵形， 直 径5‑10 μm， 被认 为是最具潜力的大规模生产菌种， 也是第一个完成基因组测序的真核生物， 测序工作于1996年完成。 同时， 酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类， 具有生长周期短、 发 酵能力强、 容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、 氨基酸、 维生素、 生物活性物质等丰 富的营养成分等优点， 且野生型酿酒酵母的主产物为乙醇， 一直是基础及应用研究的主要 对象， 在食品、 医药等领域应用广泛， 也被用于其 他具有重要工业 价值代谢产物的发酵。 [0003]而目前传统的白酒固态发酵菌体系采用多菌种共发酵体系， 通过简单的OD比色法 无法判断样本中酿酒酵母单一菌种的含量， 荧光定量PCR法虽然通过结合特异性引物或探 针可以实现混菌系统中酿 酒酵母单一菌种的定量， 但是需要 大型仪器设备和高标准的操作 规范。 [0004]因此， 构建一种快速、 准确、 特异性的定量检测酿酒酵母的方法对于酿酒酵母的发 酵领域具有重要意 义。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种快速、 准确的识别酿酒酵母的 特异性探针、 定量检测方法及应用。 本发明采用独特设计的探针对酿酒酵母的26S  rDNA进 行定量等温扩增分析， 以分析大曲和酒醅 中酿酒酵母的变化趋势， 用来监控发酵生产过程。 本发明的方法具有检测速度快， 灵敏度高， 准确性好， 特异性好， 免培养， 简便易操作等优 点。 [0006]为了实现上述目的， 本发明首先提供酿酒酵母的特异性探针， 其包括杂 交链式反 应探针H1、 H2和底物发夹探针H3； 其中， 杂交链式反应探针H1、 H2核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示； 底 物发夹探针核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 [0007]本发明还提供了酿酒酵母比色定量检测的方法， 包括如下步骤： 将待测样品与杂 交链式反应探针缓冲液混合后充分反应， 然后加入底物发夹探针反应， 再加入氯化血 红素、 ABTS以及过 氧化氢混合反应， 根据混合溶 液最终颜色定量待测样品中的酿酒酵母。 [0008]其中， 所述待测样品的采集和预处理方法为酚抽提法、 甲酰胺解聚法、 玻璃棒 缠绕 法、 异丙醇沉淀法、 表面活性剂快速制备法、 加热法、 碱变性快速制备法中至少一种。 [0009]其中， 所述反应缓冲液包括： 10mM  Tris‑HCl， 0.5mM  MnCl2， 50nM KCl， 100nM   NaCl， pH＝7.4。 [0010]其中， 所述待测样品是提取 的酿酒酵母DNA原液稀释到0.1～100nM  DNA浓度的酿说　明　书 1/6 页 3 CN 115044701 A 3