(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210723974.7 (22)申请日 2022.06.23 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO： 40139 202 2.04.24 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学东路174 号 (72)发明人 吴圣进　陈雪凤　刘增亮　张雯龙　 蒋建明　 (74)专利代理 机构 广西中知华誉知识产权代理 有限公司 45140 专利代理师 陆丽婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别 方法 (57)摘要 本发明涉及分子标记 技术领域， 特别涉及鉴 别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法， 本 发明的引物P1和受体融香7号的特异性引物d引 物对和e引物对都可以快速准确的鉴别以香菇融 香7号为供体、 以商品菌株808的单孢菌株为受体 的双单杂交后代， 特异性条带d和e分别位于 供体 的两个核基因组内， 上述引物能快速对d和e条带 进行标记和扩增， 当杂交后代拥有d或e条带时， 为杂交成功的杂合子， 同时拥有d和e条带时， 为 未杂交成功的供体亲本融香7号， d和e条带均没 有时， 为未杂交成功的受体单孢菌株， 该方法能 快速、 精准鉴别香菇双单杂交菌株的杂合子和非 杂合子， 为香菇杂交选育和遗传分析提供了技术 支撑。 权利要求书2页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 114891920 A 2022.08.12 CN 114891920 A 1.鉴别香菇双 单杂交杂合子的引物， 其特征在于， 所述引物为P1， 其核酸序列如SEQ  ID  NO.1所示； 所述香菇双单杂交的供体亲本为融香7号的双核菌株； 所述融香7号的保藏编号 为CGMCC NO： 40139。 2.根据权利要求1所述的引物， 其特征在于， 所述引物P1可同时标记位于融香7号两个 不同核的特异性条带d和e， 所述d条带的核酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述e条带的核酸序 列如SEQ ID NO.3所示。 3.根据权利要求2所述的特异性条带， 其特征在于， 所述d条带的特异性扩增引物对为d 引物对， 其正向引物序列如SEQ  ID NO.4所示， 反向引物序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述e条 带的特异性扩增引物对为e引物对， 其正 向引物序列如SEQ  ID NO.6所示， 反向引物序列如 SEQ ID NO.7所示。 4.应用如权利要求1所述引物对香菇的双单杂合子进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述 方法包括如下步骤： (1)获取香菇亲本单孢菌株， 任意选取一定数量单孢菌株分别与双核菌株 融香7号进行 杂交， 挑取杂交子代的菌 丝提取杂交子代样本的总DNA； (2)应用如权利要求1所述的引物对两个亲本进行扩增， 通过比对获得位于双核菌株 融 香7号两个核上的特异性条 带d或e； (3)然后对步骤(1)获得的杂 交子代样本总DNA进行PCR扩增， 进行对比， 当扩增产物中 含有d或e特异性条带， 则判定该杂交子代样本为杂交成功的杂合子； 若扩增产物中d和e特 异性条带均没有， 则判定该杂交子代样本为未杂交成功的单孢菌株亲本； 若扩增产物中同 时含有d和e 条带， 则判定该杂交子代样本为未杂交成功的双核菌株亲本融香7号。 5.根据权利 要求4所述双单杂合子进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)PCR反应 体系为： 10 μL的2 ×Taq PCR MasterMix， 10 μmol/L的引物 1μL， 150n g的模板DNA  1μL， 8 μL的 ddH2O； PCR反应条件为： 94℃预变性5min， 94℃变性30s、 54℃复性45s、 72℃延伸90s、 循环35 次， 72℃补平7mi n， 4℃保存。 6.应用如权利要求3所述d引物对和e引物对进行香菇 的双单杂合子鉴别的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)获取香菇亲本的单孢菌株， 任意选取一定数量单孢菌株分别与双核菌株 融香7号进 行杂交， 挑取杂交子代的菌 丝提取杂交子代样本的总DNA； (2)采用所述d引物对和e引物对分别对步骤(1)的杂交子代样本总DNA进行PCR扩增， 当 仅d引物对或e引物对有扩增产 物时， 则判定该杂交子代样本为杂交成功的杂合子， 当d引物 对和e引物对均没有扩增产 物时， 则判定该杂交子代样本为未杂交成功的单孢菌株亲本， 当 d引物对和e引物对均有扩增产 物时， 则判定该杂交子代样本为未杂交成功的双核菌株亲本 融香7号。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)d引物对的PCR反应体系为： 10 μL的2×Taq PCR MasterMix， 10μmol/L的正反引物各1μL， 150ng的模板DNA  1μL， 7μL的 ddH2O； PCR反应条件为： 94℃预变性5min， 94℃变性30s、 60℃复性45s、 72℃延伸60s、 循环35 次， 72℃补平7mi n， 4℃保存。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)e引物对的PCR反应体系为： 10 μL的2×Taq PCR MasterMix， 10μmol/L的正反引物各1μL， 150ng的模板DNA  1μL， 7μL的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891920 A 2ddH2O； PCR反应条件为： 94℃预变性5min， 94℃变性30s、 65℃复性45s、 72℃延伸60s、 循环35 次， 72℃补平7mi n， 4℃保存。 9.如权利要求1所述引物P1或如权利要求3所述d引物和e引物对在选育、 筛选和/或鉴 别香菇双单杂交杂合子上的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891920 A 3