(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210643734.6 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 宁波检验检疫科 学技术研究院 （宁 波国检贸易便利化 服务中心） 地址 315000 浙江省宁波市 鄞州区惠康路8 号 (72)发明人 段维军　郭立新　吕燕　李雪莲　 张慧丽　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 张羽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 长孢轮枝菌实时荧光PCR探针引物组及检测 试剂盒和应用 (57)摘要 本发明公开了一种长孢轮枝菌实时荧光PCR 探针引物组及检测试剂盒和应用。 该探针引物组 包括引物对和探针， 所述引物对为如下任一种： a1)由SEQ  ID No.1所示的单链DNA和SEQ  ID  No.2所示的单链DNA组成的引 物对； a2)由将SEQ   ID No.1和SEQ  ID No.2经过一个或几个核苷酸 的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的 两条单链DNA分子组成的， 且与a1)中所述引物对 功能相同的引物对； 所述探针为核苷酸序列为 SEQ ID No.3的单链DNA 。 该引物探针组采用针对 长孢轮枝菌的特异引物对进行目标基因片段的 扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行 检测， 提高了特异性， 有效地避免假阳性和假阴 性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 114807428 A 2022.07.29 CN 114807428 A 1.用于检测长孢轮枝菌的引物探针组， 其特 征在于： 包括引物对和探针， 所述引物对为如下任一种： a1)由SEQ  ID No.1所示的单链DNA和SEQ  ID No.2所示的单链DNA组成的引物对； a2)由将SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添 加后所得序列所示的两条 单链DNA分子组成的， 且与a1)中所述引物对功能相同的引物对； 所述探针为核苷酸序列为SEQ  ID No.3的单链DNA。 2.根据权利要求1所述的引物探针组， 其特征在于： 所述探针的5 ’端标记有荧光报告基 团， 3’端标记有荧 光淬灭基团。 3.用于长孢轮枝菌的引物对， 其特 征在于： 为权利要求1中的所述引物对。 4.用于检测长孢轮枝菌的试剂盒， 其特征在于： 含有权利要求1或2所述的引物探针组 或权利要求3所述的引物对。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于： 还 含有实时荧 光PCR扩增缓冲液。 6.权利要求1或2所述的引物探针组、 权利要求3所述的引物对或权利要求4或5所述的 试剂盒在 如下中的应用： (1)检测或辅助检测长孢轮枝菌； (2)检测或辅助检测待测样本是否含有长孢轮枝菌； (3)制备检测或辅助检测长孢轮枝菌的产品； (4)制备检测或辅助检测待测样本是否含有长孢轮枝菌的产品。 7.一种长孢轮枝菌的检测方法， 其特征在于： 包括以待测样本的DNA为模板， 采用权利 要求1或2所述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号， 根据所述荧光信号判断待测 样本是否有或候选有长孢轮枝菌 。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于： 所述荧光定量PCR中， 组成所述引物对 的两条单链DNA浓度均为10 μM， 在10 μL反应体系中用量均为0.8 μL； 所述探针浓度为10 μM， 在 10 μL反应 体系中用量 为0.8 μL。 9.根据权利要求7或8所述的检测方法， 其特征在于： 所述根据所述荧光信号判断待测 样本是否有或候选有长孢轮枝菌为： 当所述荧光信号出现特异 性扩增曲线且特异性扩增超 过阈值线， 则表明所述待测样本有或候选有长孢轮枝菌； 当所述荧光信号没出现阳性扩增 曲线或特异性扩增没超过阈值线， 则表明所述待测样本无或候选无长孢轮枝菌 。 10.一种长孢轮枝菌的检测方法， 其特征在于： 包括以待测样本的DNA为模板， 采用权利 要求3所述引物对进行PCR扩增， 然后按照如下确定所述待测样本中是否含有长孢轮枝菌： 如果获得特异性扩增产物， 则所述待测样本有或候选有长孢轮枝菌； 如果没获得特异性扩 增产物， 则所述待测样本中没有或候选没有长孢轮枝菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807428 A 2长孢轮枝菌实时荧光PCR探针引物组及检测试剂盒和应用 技术领域 [0001]本发明涉及植物病原真菌的检测领域， 具体涉及一种长孢轮枝菌实时荧光PCR探 针引物组及检测试剂盒和应用。 背景技术 [0002]长孢轮枝菌Verticillium  longisporum(C.Stark)Karapapa， Bainbr.&Heale， 隶 属于真菌界(Fungi)， 子囊菌门(Ascomycota)， 盘菌亚门(Pezizomycotina)， 粪壳菌纲 (Sordariomycetes)， 肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)， 小丛 壳目(Glomerell ales)， 不整 小球囊菌科(Plectosphaerellaceae)， 轮枝菌属(Verticillium)。 长孢轮枝菌是近年来新 发的植物病害， 目前主要分布于欧洲的瑞典、 德国、 英国、 比利时和 俄罗斯， 北美洲的美国和 加拿大， 亚洲的日本和中国。 该病菌是一类土传真菌， 主要造成维管束病害， 可造成严重经 济损失。 迄今为止， 国内外长孢轮枝菌检测鉴定技术局限于形态学及普通PCR检测方法， 需 要进行跑胶等后续处理， 操作较为繁琐， 耗时较长， 对于亲缘关系较近的种类如大丽轮枝菌 和长孢轮枝菌无法实现一步区分， 且对检测人员专业素质要求较高， 难以满足快速、 准确、 灵敏鉴定的检测要求。 发明内容 [0003]本发明的目的之一在于提供操作简单、 快速、 准确鉴别长孢轮枝菌的引物探针组。 [0004]本发明提供了用于检测长孢轮枝菌的引物探针组， 包括引物对和探针， [0005]所述引物对为如下任一种： [0006]a1)由SEQ  ID No.1所示的单链DNA和SEQ  ID No.2所示的单链DNA组成的引物对； [0007]a2)由将SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的， 且与a1)中所述引物对功能相同的引物 对； [0008]所述探针为核苷酸序列为SEQ  ID No.3的单链DNA。 [0009]可选地， 根据上述的引物探针组， 所述探针的5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记 有荧光淬灭基团。 所述荧光报告基团可为FAM、 TET、 VIC或JOE等。 所述荧光淬灭基团可为 MGB。 [0010]本发明还提供了用于 长孢轮枝菌的引物对， 具体为上述引物对。 [0011]本发明还提供了用于检测长孢轮枝菌的试剂盒， 含有上述的引物探针 组或上述的 引物对。 [0012]可选地， 根据上述的试剂盒， 还含有实时荧光PCR扩增缓冲液， 例如2x Universal PCR Master Mix反应缓冲液。 [0013]上述的试剂盒具体可包括2x Universal  PCR Master Mix反应缓冲液、 摩尔浓度均为10 μmo l/L的所述引物对和所述探针。说　明　书 1/5 页 3 CN 114807428 A 3