(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210689687.9 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 南京海关动植物与食品检测中心 地址 210019 江苏省南京市 建邺区创智路 39号 (72)发明人 李井干　吴晶　余本渊　许忠祥　 伏见国　杨晓军　李洋　郭静　 刘晓宇　杨静　 (74)专利代理 机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 1 1108 专利代理师 张洪年 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 龟甲牡丹PEPC基因序列及其在基于KASP的 龟甲牡丹鉴别中的应用 (57)摘要 本发明涉及分类鉴定学领域， 特别是涉及分 子鉴定方法领域， 更为具体的说是涉及龟甲PEPC 基因序列及其在基于KASP的龟甲牡丹鉴别中的 应用。 本发明中公开的龟甲牡丹PEPC基因尚未报 道过， 本发明的发明人以该PEPC基因为基础， 获 得具有鉴定龟甲牡丹的特异性SNP位点。 从而能 够利用KASP基因分型技术， 通过设计KASP特异性 引物， 准确鉴定龟甲牡 丹。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114958873 A 2022.08.30 CN 114958873 A 1.龟甲牡 丹PEPC基因序列， 其特 征在于： 所述PEPC基因序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.权利要求1所述的龟甲牡 丹PEPC基因序列在鉴别或辅助鉴别龟甲牡 丹中的应用。 3.一种检测龟甲牡丹中PEPC基因序列中的SNP位点的物质在鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹 中的应用， 其特 征在于， 所述SNP位 点为PEPC基因序列中第152号核酸 位点， 其碱基为G。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述物质为如SEQ  ID NO:2所示的正向引 物PCC‑A‑fis‑f1‑1、 如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑2以及如SEQ  ID NO:4所 述的反向引物PC C‑A‑fis‑r1组成的引物组合。 5.一种试剂盒， 所述试剂盒包含如SEQ  ID NO:2所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑1、 如 SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑2以及如SEQ  ID NO:4所述的反向引物PCC ‑A‑ fis‑r1。 6.权利要求5所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别黑牡 丹中的应用。 7.一种鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹的方法， 包括如下步骤： 对待检测样品基因DNA进行 PCR扩增， 得到待检测PCR扩增产物； 然后对PCR扩增产物进行KASP反应， 并根据基因分型结 果， 确定其是否为龟甲牡 丹。 8.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增 采用核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑1、 如SEQ ID NO:3所示的正 向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑2以及如SEQ  ID NO:4所述的反向引物PCC ‑A‑fis‑r1组成的引物组 合。 9.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法， 其特征在于： 所述如SEQ  ID  NO:2所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑1的5′端加上GAAGGTGA CCAAGTTCATGCT接头序列、 如SEQ   ID NO:3所示的正向引物PC C‑A‑fis‑f1‑2的5’端加上GA AGGTCGGAGTCAACGGATT接头序列。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958873 A 2龟甲牡丹PEPC 基因序列及其在基于KASP的龟甲牡丹鉴别中的 应用 技术领域 [0001]本发明涉及分类鉴定学领域， 特别是涉及分子鉴定方法领域， 更为具体的说是涉 及龟甲牡 丹PEPC基因序列及其在基于KAS P的龟甲牡 丹鉴别中的应用。 背景技术 [0002]龟甲牡丹Ariocarpus  fissuratus属仙人掌科岩牡丹属， 原产墨西哥。 龟甲牡丹是 岩牡丹属里面是爱好者最喜欢的一个品种， 也是大家最熟悉的的一个品种， 其生长速度很 慢， 被誉为 “活着的石头 ”。 在世界自然保护 联盟(IUCN)濒危物种红色名录中被评为 “濒危” 级别， 同时被列入 《濒危野生动植物种国际贸易公约》 (CITES)附录 Ⅰ， 除有国家机关证明为 非商业进出口行为， 禁止一切国际间的植株贸易。 [0003]目前对龟甲牡丹的鉴定以形态学为主。 形态学鉴定需要有经验的专业鉴定人员， 各海关口岸普遍缺 乏形态鉴定专家； 且龟甲牡丹和勃士牡丹在形态上比较相似， 本属幼株 形态上难以区别， 因此急需要研究开 发新的龟甲牡丹的鉴定方法， 从而能够快速、 准确鉴定 龟甲牡丹， 并降低对形态学专业 鉴定人员的依赖性。 [0004]竞争性等位基因特异 性PCR(kompet itive allele‑specific  PCR， KASP)技术是近 些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。 KASP技术既有准确度， 又降低 了成本， 更 具SNP位点适用性， 在物种鉴定上有很好的应用潜力。 [0005]应用KASP技术的核心是寻找准确的SNP位点， SNP是单核苷酸多态性(single   nucleotide  polymorphism， SNP)的缩写， 是一种 普遍分布在植物基因组中， 被广泛应用于 性状基因的精细定位和分子 辅助育种等领域的标记位 点。 发明内容 [0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种新的准确、 快速鉴定龟甲牡丹的方法， 特 别是一种龟甲牡丹的生物学鉴定方法， 从而降低形态学鉴定方法对专业鉴定人员的依赖 性。 [0007]为了解决上述技术问题， 本发明公开了龟甲牡丹PEPC基因序列， 所述PEPC基因序 列如SEQ ID NO:1所示。 [0008]进一步地， 本发明还公开了所述龟甲牡丹PEPC基因序列在鉴别或辅助鉴别黑牡丹 中的应用。 [0009]同时， 在本发明中还公开了一种检测龟甲牡丹PEPC基因序列中的SNP位点的物质 在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用， 并限定所述SNP位点为PEP C基因序列中第152号核酸位 点， 其碱基为G。 [0010]进一步地， 上述物质为如S EQ ID NO:2所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑1、 如SEQ ID  NO:3所示的正向引物PCC ‑A‑fis‑f1‑2以及如SEQ  ID NO:4所述的反向引物PCC ‑A‑fis‑r1组 成的引物组合。说　明　书 1/4 页 3 CN 114958873 A 3