ICS 65.020.30 CCS B 43 12 天津市 地方 标准 DB12/T 1328—2024 畜禽养殖粪污中典型致病菌检测 三重数字 PCR法 Detection of typical pathogenic bacteria in livestock waste —Triple digital PCR method 2024 - 07 - 01发布 2024 - 09 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1328 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、天津市动物疫病预防控制中心、新疆农垦科学 院、天津市农业科学院 。 本文件主要起草人： 杜连柱、程深伟、张克强、梁雨、王健春、尹春博、刘福元、郜兴亮、杨井泉 、 苏蘩。 DB12/T 1328 —2024 1 畜禽养殖粪污中典型致病菌检测 三重数字 PCR法 1 范围 本文件规定了畜禽养殖粪污中 典型致病菌 的三重数字 PCR检测方法 的原理、试剂和材料、仪器设 备、操作步骤、结果 分析与表述 及生物安全 措施。 本文件适用于天津市畜禽养殖粪污中 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、沙门氏菌 的快速定 量检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 —2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 —2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 25171 —2023 畜禽养殖环境与废弃物管理术语 GB/T 27403 —2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 27522 —2023 畜禽养殖污水 监测技术规范 SN/T 4853 转基因大米定量检测 数字PCR法 SN/T 5334.1 —2020 转基因植物产品的数字 PCR检测方法 第1部分：通用要求与定义 3 术语和定义 GB/T 25171 —2023、SN/T 5334.1 —2020界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 微滴式数字 PCR系统采用毛细通道网格将 数万个微滴离散进入 2D芯片，从而有效地实现反应体系的 精准分割。该系统利用金黄色葡萄球菌的 nuc、大肠埃希氏菌 O157:H7的rfbE以及沙门氏菌的 FimY特异性 基因序列对畜禽养殖粪污中典型致病菌进行检测。在 PCR扩增后，通过泊松分布校正阳性微滴的数量和 比例，可以准确计算靶基因序列的起始拷贝数或浓度，从而同时实现对三种病原体的快速定量检测。 5 仪器和设备 所需仪器和设备 如下： a） 微滴生成系统； b） PCR仪； c） 微滴阅读分析系统； d） 高速冷冻离心机 ：控温 4℃8℃，离心力不小于 12 000 g /min； e） 分析天平： 精度 0.01 g；