ICS B41 65.020.30 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/ T 1827—2011 猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测技术 Real-time PCR Assay for the Detection of Porcine Circovirus Type 2 2011 - 04 - 08 发布 山东省质量技术监督局 2011 - 06 - 01 实施 发 布 DB37/ T XXXX—XXXX 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、时建立、吴晓燕、丛晓燕、孙文博、杜以军。 I DB37/ T XXXX—XXXX 猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型(PCV2)荧光PCR检测技术的要求。 本标准适用于猪血清和组织中猪圆环病毒2型的检测。 2 2.1 材料 器材 2.1.1 微量移液器(最大量程为 10μL、20μL、100μL、1000μL) 2.1.2 20 000g 高速冷冻离心机 2.1.3 紫外分光光度计 2.1.4 PCR 仪 2.2 荧光定量 PCR 仪试剂 2.2.1 质粒提取试剂盒 2.2.2 SYBR Green Ⅰ核酸染料 2.2.3 凝胶回收试剂盒 2.2.4 蛋白酶 K(见附录 A.1 章) 2.2.5 10%SDS 液（见附录 A.2 章） 2.2.6 70%乙醇（见附录 A.3 章） 2.2.7 1%琼脂糖凝胶（见附录 A.4 章） 2.2.8 DNA Marker 2000 2.3 引物 Y1：5’-GCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTT-3’ Y2：5’-GAGTGGGCTCCAGTGCTGTTAT-3’ 3 方法 3.1 质粒标准阳性模板的制备 3.1.1 质粒的构建及鉴定 利用普通PCR技术扩增出PCV2的ORF2基因702bp片段, 凝胶回收后克隆到克隆载体。纯化质粒，并转化DH5α 感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定。 3.1.2 重组质粒浓度的测定 将阳性重组质粒作20倍稀释，用紫外分光光度计测定其浓度，并计算标准品的拷贝数。 3.1.3 标准品制备 10 9 8 7 6 5 将重组质粒稀释至1.0×10 拷贝/μL后再倍比稀释，分别以10 、10 、10 、10 、10 拷贝/μL5个梯度作为 标准品模板，-70℃保存备用。 1 DB37/ T XXXX—XXXX 3.2 病毒基因组的提取 对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA。 3.2.1 病料处理：取小块病料组织于研钵中，用剪刀剪碎，加入 2mLPBS 缓冲液，研磨。 3.2.2 取研磨液 500μL 于 1.5mL 离心管中，加入 50μg/mL 的蛋白酶 K 5μL，加入 10%的 SDS 溶液 25μL， 55℃水浴 2-3h。 3.2.3 加入 200μL Tris 饱和酚，充分混匀，10000g 离心 15min。 3.2.4 取上清于一新的离心管中，加入 200μL Tris 饱和酚和 200μL 氯仿，10000g 离心 15min。 3.2.5 取上清于一新离心管中，加入 200μL 氯仿，10000g 离心 15min。 3.2.6 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20℃静止 20min，10000g 离心 15min，弃上清。 3.2.7 加入 70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 3.2.8 加入 100μL 灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。 3.3 荧光定量 PCR 体系，详见表 1。 表1 荧光定量 PCR 反应体系 步骤1 SYBR Green Ⅰ核酸染料 12.5μL 步骤2 引物Y1 1.0μL 步骤3 引物Y2 1.0μL 步骤4 DNA 2.0μL 步骤5 超纯水 8.5μL 总量 25.0μL 荧光定量PCR程序设定 每次PCR均应设一个阴性对照，具体参数见表2。 表2 荧光定量 PCR 反应程序设定 温度 时间 步骤1 95℃ 3min 步骤2 95℃ 10s 59℃ 步骤3 4 收集信号 10s 95℃ 2min 60℃ 20s 95℃ Continue 结果判定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。 4.1 标准曲线 9 8 7 6 5 选择10 、10 、10 、10 、10 拷贝/μL5个梯度浓度的质粒作为模板，制作出动力学曲线和标准曲线。建立 的标准曲线斜率为-3.304，轴截距为39.051，线性方程为Y=-3.394X+39.051，相关系数为0.994。 荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为10拷贝/μL，而且不能扩增出PCV1、PPV、PRV病毒DNA，有很好的 特异性。 4.2 质控标准 2 DB37/ T XXXX—XXXX 4.2.1 4.2.2 4.3 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 阳性对照 Ct 值≤35，并出现特定扩增曲线。否则，则此试验视为无效。 结果描述及判定 4.3.1 阴性 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无PCV2病毒。 4.3.2 阳性 Ct值≤35，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在PCV2病毒。 4.3.3 有效原则 Ct值﹥35的样品须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。 3 DB37/ T XXXX—XXXX AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液(20mg/mL) 蛋白酶K 灭菌双蒸水 A.2 10%十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2) 十二烷基硫酸钠 灭菌双蒸水 浓盐酸 灭菌双蒸水 A.3 10g 80mL 调pH至7.2 加至100mL 70%乙醇 无水乙醇 灭菌双蒸水 A.4 100mg 5mL 70mL 30mL 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖 0.5×TBE缓冲液 0.6g 60mL _________________________________ 4