UDC628.515:543.062 z 15 中华人民共和国国家标准 GB/T 15441-1995 水质 急性毒性的测定 发光细菌法 Water quality--Determination of the acute toxicity -Luminescent bacteria test 1995-03-25发布 1995-08-01实施 国 家环 境 保护局 发布 家技 术 监督局 中华人民共和国国家标准 GB/T15441-1995 水质急性毒性的测定发光细菌法 Water quality--Determination of the acute toxicity -Luminescent bacteria test 1主题内容与适用范围 1.1主题内容 本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法。 1.2适用范围 本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测。 2方法提要 基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05），因而可通过生物发光 光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。 水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选 用ECso值（半数有效浓度一一以样品液百分浓度为单位)来表征。 3试剂和材料 本标准所用试剂除另有说明外，均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。 3. 1氯化汞 HgCl2。 3.2氯化钠NaCl,化学纯。 3.3明亮发光杆菌T：小种（PhotobacteriumphosphoreumT：spp.）冻干粉，安瓶包装，每瓶0.5g，在 2～5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细 胞；当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后 每毫升菌液不低于1.6万个细胞（5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）（均为稀释平板法测定）。在 毒性测试仪上测出的初始发光量应在600～1900mV之间，低于600mV允许将倍率调至“X2”档，高 于1900mV允许将倍率调至"X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。 3.4氯化钠溶液，3g/100ml。 氯化钠3g于玻璃容器内，用量筒加蒸馏水100ml。 3.5氯化钠溶液，2g/100ml。 氯化钠2g，加蒸馏水100ml，于试剂瓶内，2～5℃保存。 3.6参比毒物氯化汞标准溶液。 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24mg/L。 3.7氯化汞母液，p=2000mg/L。 万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶，用3g/100ml 氯化钠溶液稀释至刻度，置25℃冰箱备用，保存期6个月。 国家环境保护局1995-03-25批准 1995-08-01实施 1 GB/T15441-1995 3.8氯化汞工作液，p=2mg/L。 用移液管吸氯化汞2000mg/L母液10ml入1000ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容。再 用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml入250ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入 配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3g/100ml氯化钠溶液将氯化汞2mg/L溶液按表1稀释成系列 浓度（一律采用50ml容量瓶）。这些氯化汞稀释液保存期不超过24h，超过者务必重配。 表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50ml容量瓶中） 加氟化汞（2mg/L）数，ml 0.5 1.0 1.5 ,2.0 2.5 3.0 3. 5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 稀释定容后氟化汞浓度，mg/L 0.020.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0. 20 0.220.24 4仪器 4.1生物发光光度计。 配置2或5ml测试管。 当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过士10%。 4.22ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造）， 分别适用于相应型号的生物发光光度计。 4.3微量注射器：10ul。 4.4注射器：1ml。 4.5定量加液瓶：5ml。 4.6吸管：2、10、25ml。 4.7试剂瓶：100ml。 4.8量筒：100、500ml。 4.9棕色容量瓶：50、250、1000ml。 4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：10ml。 5样品 5.1样品的采集和保存 a．采样瓶使用带有聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留 空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。 b．毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在2～5℃下保存样品，但不得超过24h。报告中应写 明水样采集时间和测定时间。 c，对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。 5.2样品液的稀释 5.2.1样品液测定前稀释的条件 5.2.1.1样品液预试验取事先加氯化钠至3g/100ml浓度的样品母液2ml装入样品管，并设一支 CK管（氯化钠3g/100ml溶液），按6所述测定相对发光度。 5.2.1.2按5.2.1.1测得的样品，相对发光度低于50%乃至零，欲以ECs表达结果，则须稀释。 5.2.1.3按5.2.1.1测得的样品，相对发光度在1%以上，欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达 结果，则不须稀释。 5.2.2样品液的稀释液 样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml浓度添加氟化钠或浓溶液 （母液只能加固体）。 5.2.3样品液稀释浓度的选择 GB/T 15441—1995 5.2.3.1探测试验 按对数系列将样品液稀释成5个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（它们的对数依次为0，一1， 2，一3，一4），按6所述粗测一遍视1%～100%相对发光度落在哪一浓度范围。 5.2.3.2试验 在1%~100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配6～~9个浓度(例如,若落在0.1%～10%之 间，则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1%~10%之间，则 应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%），按6所述再测一遍；这6～9个浓度，也可通过查对数表，按等 对数间距原则自行确定（例如，若落在1%～10%之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、 1.58%、1.00%，它们的对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，对数间距均为0.2)。 6 测定 6.1测定条件 6.1.1室温 室温20~25℃。 同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过土1℃。且所有测试器血及试剂、溶液测前1h均置 于控温的测试室内。 6. 1.2 pH 若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。 若须测定排除pH影响在内的急性毒性，须将水样和CK（氯化钠3g/100ml)pH测前调至下值：主 要含Cu水样为4.5，主要含其他金属水样为5.4，主要含有机化合物水样为7.0。 6.1.3溶解氧 本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。 6.2测定步骤 6.2.1试管的排列 于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管。 6.2.1.1按5.2.1.3所述，样品母液相对发光度为1%以上者，如下排列： 左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对 照（CK)管，后二排放CK预试验管。每管氯化汞或样品液均配一管CK（氮化钠3g/100ml蒸馏水溶 液）。设3次重复。每测一批样品，均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液。 表2试管在试管架上的排列 后二排 CK预试1 CK预试2 后一排 CK sCK CK CK CK CK CK CK CK CK CK 前 排 0.020.020.020.040.040.04 0.24！样1 样1 样1 样2 样2样2… 样n 管 群 氯化汞（mg/L） 样品 6.2.1.2按5.2.1.2所述，样品母液相对发光度为50%以下乃至零者，如下排列： 左侧仅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度，它反应 15min的相对发光度应在50%左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同 6.2.1.1。每测一批样品，均须同时配测氯化汞0.10mg/L溶液。 6.2.2加3g/100ml氯化钠溶液 用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5ml氯化钠3g/100ml(据仪器型号而定）。 6.2.3加样品液 3 GB/T15441-1995 用2或5ml吸管给每支样品管加2或5ml样品液（据6.2.2而定）。每个样品号换一支吸管。 6.2.4发光细菌冻干菌剂复苏 从冰箱2～5℃室取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块的小号 （1~1.5L）保温瓶，用1ml注射器吸取0.5ml冷的氯化钠2g/100ml(适用于5ml测试管）或1ml冷 的氯化钠2.5%（适用于2ml测试管）注入已开口的冻干粉安瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发 光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。 6.2.5仪器的预热和调零 打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。 6.2.6仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 另取一空2或5ml测试管，