书 书 书犐犆犛 ６７ ． １８０ ． １０ 犡 ３１ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ 蜂蜜中植物花粉的测定方法 犕犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋狆狅犾犾犲狀犻狀犺狅狀犲狔 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０６  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口 。 本标准起草单位 ： 江西农业大学蜜蜂研究所 、 中国农业科学院蜜蜂研究所 、 北京百花蜂产品科技发 展有限公司 、 杭州澳医保灵药业有限公司 、 兰溪市鸿香生物科技有限公司 、 绍兴县润露绿色食品有限 公司 。 本标准主要起草人 ： 曾志将 、 魏丽 、 马兰宇 、 虞英民 、 李熠 、 汪志平 、 冯华君 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ 蜂蜜中植物花粉的测定方法 １ 　 范围 本标准规定了蜂蜜中植物花粉含量及浓度的测定方法 。 本标准适用于蜂蜜 ， 不包括蜂蜜制品 。 ２ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ２ ． １ 花粉 　 狆狅犾犾犲狀 由一个营养细胞和 １ 个 ～ ２ 个生殖细胞组成的显花植物的雄性种质 。 ２ ． ２ 蜂花粉 　 犫犲犲狆狅犾犾犲狀 工蜂采集花粉 ， 用唾液和花蜜混合后形成的物质 。 　　 注 ： 包括工蜂采集形成的团粒和人工粉碎加工形成的粉末 。 ２ ． ３ 蜂蜜 　 犺狅狀犲狔 ； 犫犲犲犺狅狀犲狔 蜜蜂采集植物的花蜜 、 分泌物或蜜露 ， 与自身分泌物结合后 ， 经充分酿造而成的天然甜物质 。 ３ 　 原理 用乙酸软化蜂蜜中花粉的内含物 ， 乙酸酐和硫酸的混合液再将软化的内含物分解 ， 使花粉外壁及孔 沟清晰 ， 在显微镜下便于观测花粉形态和计数 。 ４ 　 试剂 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为蒸馏水或去离子水 。 ４ ． １ 　 乙酸 。 ４ ． ２ 　 乙酸酐 ＋ 硫酸 （ ９＋１ ， 体积比 ）： 用时现配 。 ４ ． ３ 　 甘油 。 ４ ． ４ 　 苯酚 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 烧杯 ： １５０ｍＬ 。 ５ ． ２ 　 量筒 ： ５０ｍＬ 。 ５ ． ３ 　 移液管 ： ５ｍＬ ， １０ｍＬ 。 ５ ． ４ 　 电炉 。 ５ ． ５ 　 滴管 。 ５ ． ６ 　 盖玻片 。 ５ ． ７ 　 载玻片 。 ５ ． ８ 　 离心管 ： １００ｍＬ 。 ５ ． ９ 　 离心机 （ ２０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ ５ ． １０ 　 电热恒温水浴锅 。 ５ ． １１ 　 显微镜 。 ５ ． １２ 　 血细胞计数板 。 ６ 　 试样的制备 ６ ． １ 　 未结晶的样品 ， 将其搅拌均匀 。 有结晶析出的样品 ， 在密闭情况下 ， 置于不超过 ６０℃ 的水浴中温 热 ， 振荡 ， 待样品全部融化后搅匀 ， 冷却至室温以备检验用 。 ６ ． ２ 　 称取均匀蜜样 ２５ｇ ， 加入约 ４０℃ 的 ５０ｍＬ 蒸馏水 ， 使蜂蜜溶解和稀释 。 此试样溶液用于蜂蜜中 蜜源植物花粉含量的测定 。 ６ ． ３ 　 称取均匀蜜样 ２５ｇ ， 并量取蜜样的体积 。 加入约 ４０℃ 的 ５０ｍＬ 蒸馏水 ， 使蜂蜜溶解和稀释 。 此 试样溶液用于蜂蜜中蜜源植物花粉浓度的测定 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 花粉粒提取 将试样溶液 （ ６．２ ） 和试样溶液 （ ６．３ ） 分别倒入离心管中 ， 以 ２０００ｒ ／ ｍｉｎ 的速度离心 １０ｍｉｎ ， 弃去约 ４ ／ ５ 的上清液 ， 加入 ５ｍＬ 乙酸 （ ４．１ ） 并拌匀 ， 浸泡 ２ｈ 。 进行离心 （ ２０００ｒ ／ ｍｉｎ ， １０ｍｉｎ ）， 弃去约 １ ／ ２ 的 上清液 ， 加入新鲜配制的乙酸酐和硫酸的混合液 （ ４．２ ） ６ｍＬ ， 并拌匀 ， 然后将离心管放入 ８０℃ ～ ９０℃ 水 浴中加热 ７ｍｉｎ 。 停止加热后 ， 迅速离心 （ ２０００ｒ ／ ｍｉｎ ， １０ｍｉｎ ）， 弃去 ５ｍＬ 上清液 ， 加 １０ｍＬ 蒸馏水洗 涤 ， 离心水洗三次后 ， 弃去上清液 ， 使试样溶液 （ ６．２ ） 留下约 ５ｍＬ 的样液 ， 试样溶液 （ ６．３ ） 留下 ３ｍＬ 的 样液 。 加入 １ｍＬ５０％ 的甘油 （ ４．３ ） 保存 ， 并加入 ２ 滴 ～ ３ 滴苯酚 （ ４．４ ） 作为防腐剂 （ 若当时就计数及观 察形态则可不加甘油和苯酚 ）。 ７ ． ２ 　 蜂蜜中植物花粉含量的测定 ７ ． ２ ． １ 　 制片 吸取 １ 滴样液放在载玻片上 ， 加盖玻片 ， 将边缘多余液体用滤纸吸干 。 ７ ． ２ ． ２ 　 镜检 取制好的载玻片放在低倍镜下找到花粉 ， 再在高倍镜下观察 ， 每张载玻片均匀选择 １０ 个视野观察 ， 鉴定花粉类别 ， 统计花粉粒的数量 。 我国常见蜜源植物花粉的形态参见附录 Ａ 。 　　 注 ： 显微镜下花粉含量很少时 ， 可选择有花粉的视野进行观察计数 。 ７ ． ２ ． ３ 　 平行试验 按以上步骤 ， 对同一试样进行两次平行试验测定 。 ７ ． ３ 　 蜂蜜中植物花粉浓度的测定 ７ ． ３ ． １ 　 镜检计数室 在加样前 ， 先对计数板的计数室进行镜检 。 若有污物 ， 则需清洗 ， 吹干后才能进行计数 。 ７ ． ３ ． ２ 　 加样液 用水稍微沾湿计数室两侧的支持柱 ， 以推压法将盖玻片平放在计数室表面 ， 尽量减少盖玻片与支柱 之间的空气 。 用吸管吸取制备后的样液 ， 沿盖玻片与计数室之间的缝隙充入计数室 。 ７ ． ３ ． ３ 　 显微镜计数 加样后静置 ５ｍｉｎ ， 然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上 ， 先用低倍镜找到计数室所在位置 ， 然后换成高倍镜进行计数 。 在显微镜下 ， 可见每个计数室平台上均刻有清晰的网格划线 。 由网格线围 成的正方形区域为细胞计数区 ， 最大正方形边长 ３ｍｍ ， 分为 ９ 个大方格 ， 每个大方格边长 １ｍｍ ， 面 积 １ｍｍ ２ ， 若覆以盖玻片并充满液体 ， 液体的体积为 ０．１ｍｍ ３ （ ０．１ μ Ｌ ）， 四角的四个大方格分别以单划 线分为 １６ 个方格 ， 用作计数白细胞 。 位于中央的大方格即为计数室 。 计数室的刻度一般有两种规格 ， 一种是一个大方格分成 ２５ 个中方格 ， 而每个中方格又分成 １６ 个小方格 ； 另一种是一个大方格分成 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ １６ 个中方格 ， 而每个中方格又分成 ２５ 个小方格 ， 但无论是哪一种规格的计数板 ， 每一个大方格中的小 方格都是 ４００ 个 。 由于绝大多数蜂蜜原料中花粉数量少 ， 因此在计数时直接计取每个计数室内的花粉 粒数 。 由于划线部分也占有计数室的总面积 ， 因此对压线花粉粒也应列入计数 ， 为避免重复计数或漏计 ， 一般遵循数上不数下 ， 数左不数右的原则 。 计数一个样液要从血细胞计数板内两个计数室中取得的平均数值来表示样液中花粉粒的数量 。 我 国常见蜂蜜中花粉浓度的调查数据参见附录 Ｂ 。 ７ ． ３ ． ４ 　 清洗血细胞计数板 使用完毕后 ， 将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净 ， 但不应用硬物洗刷 。 洗完后自行晾干或用 吹风机吹干 。 镜检 ， 观察每小格内是否残留花粉或其他沉淀物 。 若不干净 ， 应重复洗涤至干净为止 。 ７ ． ３ ． ５ 　 平行试验 按以上步骤 ， 对同一试样进行两次平行试验测定 。 ８ 　 计算与表述 蜂蜜中花粉率按式 （ １ ） 计算 ； 花粉浓度按式 （ ２ ） 计算 。 犡 ＝ 犖 １ 犖 ２ × １００％ ……………………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 某种蜜源植物花粉粒占总花粉粒的比率 ； 犖 １ ——— １０ 个视野中某种蜜源植物花粉粒数 ， 单位为个 ； 犖 ２ ——— １０ 个视野中蜜源植物花粉粒总数 ， 单位为个 。 犮 ＝ 犖 犞 × ３ × １０ × １０ ３ ……………………………………（ ２ ） 　　 式中 ： 犮 ——— 某种蜜源植物花粉粒浓度 ， 单位为个每毫升 （ 个 ／ ｍＬ ）； 犖 ——— 血细胞计数板平均一个计数室中某种蜜源植物花粉粒个数 ， 单位为个 ； 犞 ——— 量取的蜜样的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）。 计算结果保留两位有效数字 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 中国主要及少数辅助商品蜂蜜中植物花粉形态特征 　　 中国主要及少数辅助商品蜂蜜中植物花粉形态特征见图 Ａ．１ ～ 图 Ａ．１８ 。 极面 ×１０５８ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． １ 　 刺槐花粉形态 极面 ×７５６ 　　 赤道面 ×７５６ 图 犃 ． ２ 　 油菜花粉形态 极面 ×１０５８ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． ３ 　 荞麦花粉形态 极面 ×１０５８ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． ４ 　 荔枝花粉形态 ４ 犌犅 ／ 犜 ２３１９４ — ２００８ 极面 ×１０５８ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． ５ 　 党参花粉形态 极面 ×１０５８ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． ６ 　 椴树花粉形态 极面 ×１２８５ 　　 赤道面 ×１０５８ 图 犃 ． ７ 　 柑桔花粉形态 极面 ×２１１７ 　　 赤道面 ×２１１７