书 书 书犐犆犛 ６５ ． １４０ 犅 ４７ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３１９５ — ２００８ 蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 紫外分光光度法 犕犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犪狋犪犾犪狊犲犻狀犫犲犲狆狅犾犾犲狀 — 犝犾狋犪狉犪狏犻狅犾犲狋狊狆犲犮狋狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉狔 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０６  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口 。 本标准起草单位 ： 广州市宝生园有限公司 、 华南农业大学 。 本标准主要起草人 ： 郑尧隆 、 刘伟 、 陈伟彬 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３１９５ — ２００８ 蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 紫外分光光度法 １ 　 范围 本标准规定了蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 。 本标准适用于蜂花粉中过氧化氢酶的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 原理 过氧化氢在 ２４０ｎｍ 波长下有强烈吸收 ， 过氧化氢酶能分解过氧化氢 ， 使反应溶液吸光度在一定范 围内随反应时间而降低 ， 根据测量吸光度的变化速度即可测定过氧化氢酶的活性 。 ４ 　 试剂 除非另有说明 ， 在分析中仅使用分析纯试剂和符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 要求的蒸馏水或去离子水 。 ４ ． １ 　 磷酸缓冲液 ： ｐＨ 为 ６．８ ～ ７．０ ， 浓度为 ５０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， 含有 １ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二胺四乙酸二钠 （ ＥＤＴＡ ）。 准确称取 １７．９１ｇＮａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ 加蒸馏水溶解并稀释至 ５００ｍＬ ， 作为 Ａ 液 ； 准确称取 ７．８０ｇＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ 加蒸馏水溶解并稀释至 ５００ｍＬ ， 作为 Ｂ 液 ； 准确量取 ５５．０ｍＬＡ 液与 ４５．０ｍＬＢ 液于 ２００ｍＬ 烧杯中 ， 加入 ０．０７ｇＥＤＴＡ ， 加蒸馏水稀释混 匀 （ 加至 １５０ｍＬ 左右 ）， 用酸度计标定至 ６．８ ～ ７．０ ， 转入 ２００ｍＬ 容量瓶中 ， 定容至刻度 ， 混匀 。 ４ ． ２ 　 过氧化氢溶液 ： 体积分数为 ０．１％ 。 准确吸取 ０．５ｍＬ３０％ 过氧化氢置于 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用磷酸缓冲液 （ ４．１ ） 定容至刻度 ， 混匀 ， 从中准确量取 １０．０ｍＬ 于 １００ｍＬ 三角锥瓶 （ 避光 ） 中 ， 再准确量取 ２０．０ｍＬ 的磷酸缓冲液 （ ４．１ ） 加入混 匀即得 。 ４ ． ３ 　 液氮 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 紫外分光光度计 。 ５ ． ２ 　 冷冻离心机 。 ５ ． ３ 　 恒温水浴锅 。 ５ ． ４ 　 酸度计 。 ５ ． ５ 　 分析天平 ： 感量 ０．１ｍｇ 。 ５ ． ６ 　 移液枪 ： １００ μ Ｌ ， ５０００ μ Ｌ 。 ６ 　 待测液的制备 称取 １ｇ 样品 ， 精确到 １ｍｇ ， 置于已用适量液氮预冷的瓷研钵中 ， 边加液氮边研磨 ， 待样品充分研 １ 犌犅 ／ 犜 ２３１９５ — ２００８ 磨后 ， 静置至研钵解冻升温后加入约 １０ｍＬ 新鲜配制的磷酸缓冲液 （ ４．１ ） 溶解 ， 转入 ２５ｍＬ 容量瓶中 ， 并用磷酸缓冲液冲洗研钵数次 ， 合并洗液并定容至刻度 。 混合均匀后将容量瓶置 ４℃ 冰箱中静置 ３０ｍｉｎ ， 取上清液在低温离心机 ４℃ 、 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 的条件下离心 １５ｍｉｎ ， 取澄清液即得待测液 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 紫外分光光度计参数为 ： 方式 ： 时间扫描 ； 波长 ： ２４０ｎｍ ； 测定时间 ： １２０ｓ ； 读数间隔 ： ５ｓ 。 ７ ． ２ 　 将样液及过氧化氢溶液 （ ４．２ ） 分别置于 ４０℃ 恒温水浴锅中 １０ｍｉｎ ， 准确吸取样液 ０．１ｍＬ 于石英 皿中 ， 将石英皿放回槽中 （ 未放石英皿前仪器已消零 ）， 再准确吸取 ２．９ｍＬ 过氧化氢溶液 （ ４．２ ） 加入石 英皿中 ， 混合均匀 ， 立即开始读数 。 ７ ． ３ 　 从 ０ｓ ～ ９０ｓ 中截取线性较好的 １ｍｉｎ ， 计算其吸光度差值 。 ８ 　 计算与表述 以 １ｍｉｎ 内过氧化氢在 ２４０ｎｍ 波长下吸光度减少 ０．０１ 的酶量为 １ 个酶活单位 （ Ｕ ）。 过氧化氢酶 活性 （ Ｕ ／ ｇ ） 按式 （ １ ） 计算 。 过氧化氢酶活性 ＝ Δ 犃 × 犞 １ ０ ． ０１ × 狋 × 犞 ２ × 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： Δ 犃 ——— 结果中选取的 １ｍｉｎ 吸光度差值 ； 犞 １ ——— 样液总体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； ０．０１ ——— ２４０ｎｍ 波长下吸光度每下降 ０．０１ 为 １ 个酶活单位 （ Ｕ ）； 狋 ——— １ｍｉｎ ； 犞 ２ ——— 测定用样液体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 样品质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果表示到整数位 ， 报告结果为平行测定结果的算术平均值 。 ９ 　 允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对标准偏差 ≤ １０％ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３１９５ — ２００８