书 书 书犐犆犛 ６５ ． １４０ 犅 ４７ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ 蜂胶中阿魏酸含量的测定方法 液相色谱  紫外检测法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳犲狉狌犾犻犮犪犮犻犱犮狅狀狋犲狀狋犻狀狆狉狅狆狅犾犻狊 — 犎犘犔犆犝犞犿犲狋犺狅犱 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０６  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 和附录 Ｃ 为资料性附录 。 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口 。 本标准起草单位 ： 杭州澳医保灵药业有限公司 、 中华全国供销合作总社蜜蜂产品标准化技术委员 会 、 中国农业科学院蜜蜂研究所 、 江苏出入境检验检疫局 、 南京大学 、 江苏老山生物科技有限公司 。 本标准主要起草人 ： 虞英民 、 胡晓岚 、 朱金梁 、 徐承智 、 周金慧 、 李公海 、 陈坤 、 练鸿振 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ 蜂胶中阿魏酸含量的测定方法 液相色谱  紫外检测法 １ 　 范围 本标准规定了蜂胶中阿魏酸含量的液相色谱测定方法 。 本标准适用于蜂胶中阿魏酸含量的测定 。 本标准的检出限 ： ４ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 原理 蜂胶中的阿魏酸经甲醇超声提取 、 沉淀 、 离心 ， 再用 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后得澄清液 ， 经反相色谱柱 分离后 ， 用液相色谱  紫外检测器测定 ， 外标法定量 ， 根据保留时间和峰面积进行定性和定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有规定外 ， 所用试剂均为分析纯 ； 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 （ 为蒸馏水或同等纯度水 ）； 未 指明用何种溶剂配制时 ， 均指水溶液 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 ０．０８５％ 磷酸溶液 （ 体积分数 ）： 量取 ０．８５ｍＬ 磷酸 ， 用水定容至 １０００ｍＬ ， 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤 。 ４ ． ３ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ４ 　 ７０％ 甲醇 （ 体积分数 ）： 量取 ７０ｍＬ 分析纯甲醇 ， 加 ３０ｍＬ 水混合均匀 。 ４ ． ５ 　 阿魏酸标准物质 ： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． ６ 　 阿魏酸标准储备溶液 （ ２００．０ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确称取 １０．０ｍｇ （ 精确到 ０．１ｍｇ ） 阿魏酸标准物质 （ ４．５ ） 于 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 加 ７０％ 甲醇 （ ４．４ ） 使其溶解并定容至刻度 ， 混匀 ， 此溶液可在温度低于 ４℃ 冰 箱中冷藏保存两个月 。 ４ ． ７ 　 阿魏酸标准工作溶液 ： 分别吸取适量的阿魏酸标准储备溶液 （ ４．６ ） １ｍＬ 、 ２．５ｍＬ 、 ５．０ｍＬ 、 １０．０ｍＬ 、 ２０．０ｍＬ 、 ４０．０ｍＬ 、 ８０．０ｍＬ 至 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用 ７０％ 甲醇 （ ４．４ ） 定容至刻度 ， 配成 ２．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ４０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ８０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １６０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 标准工作 溶液 ， 现配现用 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 液相色谱仪 ： 配有紫外检测器 。 ５ ． ２ 　 分析天平 ： 精确至 ０．１ｍｇ 。 ５ ． ３ 　 过滤膜 （ 聚偏氟乙烯微孔滤膜 Ｆ 型 ，  ２５ｍｍ ）： ０．４５ μ ｍ 。 ５ ． ４ 　 超声仪 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ ５ ． ５ 　 离心机 。 ５ ． ６ 　 匀浆仪 。 ６ 　 试样的制备与保存 ６ ． １ 　 试样的制备 从全部蜂胶样品中取出约 １００ｇ 样品 ， 装入洁净容器中分成两份 ， 密封 ， 并做标记 。 ６ ． ２ 　 试样的保存 将试样于 －１０℃ 以下保存 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 试样处理 将试样置冰柜中 －１０℃ 以下冷冻 ， 取出冷冻贮存的试样 ２０ｇ ～ ３０ｇ ， 迅速用匀浆仪打碎 ， 称取试样 ０．５ｇ （ 精确到 ０．１ｍｇ ）， 置于 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 加入 ３５ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ）， 超声 １５ｍｉｎ （ 频率为 ２５ｋＨｚ ， 功率为 ５０Ｗ ）， 加入 １０ｍＬ 水 ， 摇匀 ， 冷却到室温后 ， 用水定容至刻度 ， 混匀 ； 以 ４５００ｒ ／ ｍｉｎ 的 转速离心 ２０ｍｉｎ ， 上清液用 ０．４５ μ ｍ 滤膜 （ ５．３ ） 过滤 ， 滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定 。 ７ ． ２ 　 色谱测定 ７ ． ２ ． １ 　 液相色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： ＨｙｐｅｒｓｉｌＯＤＳ２ ， ５ μ ｍ ， ４．６ｍｍ×２００ｍｍ 。 ｂ ） 　 流动相 ： 以 ０．０８５％ 磷酸溶液 （ ４．２ ） 为流动相 Ａ ， 以甲醇 （ ４．１ ） 为流动相 Ｂ ， 以乙腈 （ ４．３ ） 为流动 相 Ｃ ， 按表 １ 进行梯度洗脱 。 表 １ 　 梯度洗脱方法 时间 ／ ｍｉｎ 流速 ／（ ｍＬ ／ ｍｉｎ ） ０．０８５％ 磷酸溶液 （ 流动相 Ａ ）／ ％ 甲醇 （ 流动相 Ｂ ）／ ％ 乙腈 （ 流动相 Ｃ ）／ ％ ０ ～ ２０ １．０ ８３ ０ １７ ２０ ～ ２１ １．０ → １．５ ８３ → ０ ０ → １００ １７ → ０ ２１ ～ ３６ １．５ ０ １００ ０ ３６ ～ ３７ １．５ ０ → ８３ １００ → ０ ０ → １７ ３７ ～ ５２ １．５ ８３ ０ １７ 　　 ｃ ） 　 梯度洗脱方法 ： 见表 １ 。 ｄ ） 　 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 ｅ ） 　 检测波长 ： ３１６ｎｍ 。 ｆ ） 　 柱温 ： ３０℃ 。 ７ ． ２ ． ２ 　 液相色谱测定 测定 ５ 个 ～ ７ 个系列浓度标准工作溶液 （ ４．７ ） 在上述色谱条件下的峰面积 ， 以峰面积对相应浓度绘 制标准工作曲线 ， 然后测定未知样品 ， 用标准工作曲线对样品进行定量 ， 使样品溶液中阿魏酸的响应值 在本法的线性范围内 。 在上述色谱条件下 ， 阿魏酸的保留时间约为 １３．９ｍｉｎ ， 阿魏酸标准物质色谱图和 含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图参见图 Ａ．１ 、 图 Ａ．２ 。 ７ ． ３ 　 平行试验 按上述步骤 ， 对同一试样进行平行试验测定 。 ７ ． ４ 　 空白试验 除不称取试样外 ， 均按上述步骤 ， 应不干扰测定 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ ８ 　 结果计算 试样中阿魏酸含量利用数据处理系统计算或按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犮 × ５０ 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中阿魏酸的含量 ， 单位为微克每克 （ μ ｇ ／ ｇ ）； 犮 ——— 试样中阿魏酸的浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； ５０ ——— 试样定容体积 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果保留三位有效数字 。 ９ 　 精密度 在对同一试样进行二次平行试验获得的二次测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 １０％ 。 本标准的研究资料参见附录 Ｂ 和附录 Ｃ 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 标准物质色谱图和含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图 犃 ． １ 　 阿魏酸标准物质色谱图 ， 见图 Ａ．１ 。 图 犃 ． １ 　 标准物质色谱图 犃 ． ２ 　 含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图 ， 见图 Ａ．２ 。 图 犃 ． ２ 　 样品色谱图 ４ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ 附 　 录 　 犅 （ 资料性附录 ） 方法学研究资料 犅 ． １ 　 线性关系考察 ： 见表 Ｂ．１ 。 表 犅 ． １ 　 含量测定线性关系试验结果 （ 狀 ： ７ ） 浓度 ／（ μ ｇ ／ ｍＬ ） ２．０ ５．０ １０．０ ２０．０ ４０．０ ８０．０ １６０．０ 峰面积 １１９３３４２７１８４０５４２７９３１０５９５７１２１４４５２７４３８８１００ ８４４３４１８ 线性方程 狔 ＝５２９７６ 狓 ＋２５１７９ 　　 犚 ２ ＝０．９９９６ 犅 ． ２ 　 紫外扫描图 ： 见图 Ｂ．１ 。 ｎｍ 　　　　　 峰值检测 序号 波长 ／ ｎｍ 吸收值 １ ３１６．４０ ０．４２１ ２ ３８６．８０ －０．００３ ３ ２５８．８０ ０．１０４ 图 犅 ． １ 　 紫外扫描图 ５ 犌犅 ／ 犜 ２３１９６ — ２００８ 附 　 录 　 犆 （ 资料性附录 ） 阿 　 魏 　 酸 　　 ＣＡＳ ： １１３５２４６ 英文名称 ： ３ （ ４ｈｙｄｒｏｘｙ３ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ ） ２ｐｒｏｐｅｎｏｉｃａｃｉｄ ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ ４ｈｙｄｒｏｘｙ３ｍｅｔｈｏｘ